光合菌发酵白酒丢糟条件研究

张 健 罗 辉 张 超 刘小彬 陈泽军 谢 刚

光合菌发酵白酒丢糟条件研究

张 健 罗 辉 张 超 刘小彬 陈泽军 谢 刚

从啤酒厂啤酒糟排水沟中以厌氧法分离得一株光合菌为菌种，对原料白酒丢糟进行预处理，采用厌氧发酵装置，以单因素与正交试验法对白酒丢糟半固态培养光合菌的条件进行了研究。结果表明，当料水比1：10（干糟g：水g）、接种量10%（w/w）、光照强度890 Lx、发酵时间5 d、发酵温度30℃、料层厚度3 cm，发酵后白酒干糟真蛋白含量可从11.7%（w/w）上升至30.2%（w/w）、粗纤维素从22.4%（w/w）下降至13.6%（w/w）、粗脂肪从 5.6%（w/w）上升至 6.7%（w/w）、粗灰分从 14.8%（w/w）下降至10.1%（w/w）、总磷从 0.5%（w/w）上升至 1.1%（w/w）、发酵干糟含水量为 10.2%（w/w），提高了白酒丢糟的饲用价值。

白酒丢糟；光合菌；发酵；蛋白；纤维素

白酒丢糟以干物质计约含粗蛋白15%、粗纤维23%、脂肪或类脂6%，还含有多种维生素和18种氨基酸。低蛋白高纤维是其重要的特征之一，并有较强的酸性易腐败变质，也有含一定丰富物质、产量大以及低成本等特点。对白酒丢糟回收利用开展的主要研究集中在生产酒精、食用菌、饲料、沼气、肥料、粗酶制剂、单细胞蛋白（主要是酵母）以及提取有用成分等方面[1-3]。光合菌（photosynthetic bacteria，简称 PSB）富含蛋白质（60%以上）、脂肪、可溶性糖类、胡萝卜素、维生素B及16种氨基酸，还含有辅酶Q10（coenzyme）、抗病毒物质（antibiotic）与促生长因子等。光合菌生命力极强、营养要求低、生长繁殖快、无毒害、无副作用，目前已广泛应用在养殖、种植、医药、环保与化工等各个行业[4-6]。另外，除增加营养、降低饲料系数外，光合菌还可起到刺激动物免疫系统，增强消化和抗病能力，促进生长的作用[7]。

目前，还未见利用白酒丢糟制作“光合菌饲料”的相关报道。利用白酒糟固态或半固态生产单细胞蛋白用作饲料的技术已有很多报道，也有一些用光和菌转化其他醪渣的报道[8]，其中有一些技术已经运用到实践中。但由于这些饲料主要应用于畜禽的辅助用料，还存在蛋白含量较低、纤维素含量高等不利因素。而光合菌在养殖业的运用中也存在菌体不好保藏、现场需周期进行扩培等不便因素。

因此，将丢糟与光合菌结合起来，对其发酵工艺进行研究，以期白酒丢糟经光合菌转化后，营养结构能得到改良，更易作为饲料，并为进一步制作出“活性光合菌白酒丢糟饲料”奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与菌种

白酒丢糟：宜宾叙府酒业公司提供；光合菌（photosynthetic bacteria,PSB）：在重啤集团宜宾分公司的糖化车间丢糟排水沟中分离得到，鉴定为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。

1.1.2 试剂、仪器与设备

纤维素酶（BR，15 U/mg，上海展云化工有限公司）；NH3水（AR，成都市科龙化工试剂厂生产）；H3PO4（AR，成都市科龙化工试剂厂生产）；氮气（工业级，成都旭源化工有限责任公司生产）。

手提式高压灭菌锅（YX280B，上海三申医疗器械有限公司生产）；双人单面超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司生产）；冰箱（DCD-254WBG，无锡松下冷机有限公司生产）；电子分析天平（T-214，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产）；数显恒温水浴锅（HH-S4，金坛市医疗仪器厂生产）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-905A，上海齐欣科学仪器有限公司生产）；离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂生产）；人工气候箱（MGC-300H，上海一恒科技有限公司生产）；万用电炉（DL-1，北京市永光明医疗仪器厂生产）；箱式电炉（SX-2.5-10，天津市泰斯特仪器有限公司生产）；光照计（LX-101LUXMETER，祥泰精机股份有限公司生产）；马福炉（SX-4-10，上海洪纪仪器设备有限公司生产）；定氮仪（KDN-08B，上海双旭电子有限公司生产）；分光光度计（T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司生产）。

1.1.3 培养基

种子培养基[9]：MgSO·47H2O 0.2 g、NH4Cl 1 g、Na2CO34 g、K2HPO40.3 g、NaCl 0.5 g、CH3CH2OH 3 g、蛋白胨1.5 g、酵母膏 1 g，H2O 定容至 1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 试验流程

①从白酒厂提取新鲜丢糟置于电热恒温鼓风干燥箱中，80℃恒温至恒重得干糟，并测定其指标；

②准确称取100 g干糟于250 ml三角瓶中，加入100 ml的 0.8%（v/v）氨水处理 2 h[10]，得氨化糟；

③用1%H3PO4调节氨化糟pH值至5.0；加入纤维素酶，加酶量为130 U（/g干糟），于水浴锅50℃处理4 h，得酶处理糟；

④用0.8%（v/v）氨水调节酶处理糟pH值至7.2，置于电炉上保持微沸蒸煮30 min，冷却至室温得蒸煮糟；

⑤按一定接种量接种光合菌发酵剂于蒸煮糟中，并加入一定量无菌水，控制一定料水比（干糟g：水g），在发酵装置中造成厌氧条件进行发酵转化，每日观察酸度变化，用0.8%（v/v）氨水调节pH值至7.2，发酵至一定时间取样，得发酵醪；

⑥将所得的发酵醪在电热恒温鼓风干燥箱中80℃恒温干燥至恒重，冷却后测定其指标。

1.2.2 发酵剂制备

采用三级培养工艺。将已分离纯化的单菌落光合菌2环接种于100 ml种子培养基中，在厌氧装置中光照强度890 Lx、30℃培养4 d；然后分出培养液按10%（w/w）接种量接种于已灭菌的100 g1.2.1节的蒸煮糟中，在厌氧装置上进行第一次扩培，培养条件不变；第二、三次扩培方法与第一次相同。以第三次扩培后的糟液作为发酵剂。

1.2.3 发酵单因素试验

按1.2.1节流程，对接种发酵阶段1.2.1节⑤的条件参数分别采用单因数试验法进行探讨，以发酵醪干糟真蛋白、粗纤维的含量作为评价指标。

①光照强度的确定：取10%（w/w）接种量、30℃恒温、培养4 d、料水比1：9（干糟g：水g）、料层厚度4 cm，变化两只白炽灯功率之和为 30、40、50、60、70、80 W的白炽灯进行光照（灯与醪层距离定取30 cm）。

②接种量的确定：取白炽灯功率60 W、30℃恒温、培养4 d、料水比1：9（干糟g：水g）、料层厚度4 cm，变化接种量 5%、7%、9%、11%、13%、15%（w/w）。

③醪液厚度的确定：取白炽灯功率60 W、30℃恒温、培养4 d、料水比1：9（干糟g：水g）、接种量10%（w/w），变化料层厚度 1、2、3、4、5、6 cm。

④料水比的确定：取白炽灯功率60 W、30℃恒温、培养 4 d、料层厚度 4 cm、接种量 10%（w/w），变化料水比（干糟g：水g）1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12。

⑤温度的确定：取白炽灯功率60 W、培养4 d、料层厚度4 cm、接种量10%（w/w）、料水比（干糟g：水g）1：9，变化培养温度 24、26、28、30、32、34 ℃。

⑥发酵时间的确定：取白炽灯功率60 W、30℃恒温、料层厚度4 cm、接种量10%（w/w）、料水比（干糟g：水g）1：9，变化培养时间 1、2、3、4、5、6 d。

1.2.4 正交试验

根据1.2.3节6个因素选取最佳工艺参数点为参考，每个因素取3个水平，进行正交试验优化。水平与因素见表1，选用L18（37）正交试验表合适。优化后重做验证试验，测定样品指标。

表1 正交试验因素与水平

1.2.5 分析方法

白酒丢糟与发酵干糟真蛋白含量采用沉淀法[11]与凯氏定氮法[12]；丢糟与发酵干糟粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、总磷、水分测定分别按“中华人民共和国国家标准”GB/T 6432—94、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6434—2006、GB/T 6437—2002、GB/T 6435—2006执行。

2 结果与讨论

2.1 光照强度

光照强度对白酒发酵糟真蛋白含量和纤维素含量的影响见图1。图1可见，白酒发酵糟中蛋白质含量随光照强度的增强，呈现先增大后减少的趋势。当光照强度从白炽灯瓦数30 W增至50 W时，白酒发酵糟中真蛋白含量从18.1%上升至29.4%；当白炽灯瓦数再增加时，真蛋白含量下降。如当白炽灯总瓦数为80 W时，真蛋白含量下降至18.8%。而发酵糟中纤维素含量随光照强度增强趋势却与蛋白质含量相反，即纤维素含量随光照强度增强有先降低、后又增大的趋势。如当白炽灯瓦数从30 W增至50 W时（890 Lx），纤维素含量从17.8%降至14.2%；后白炽灯瓦数增大至80 W时，纤维素含量又上升至16.9%。

图1 光照强度对发酵干糟真蛋白与纤维素含量的影响

光合菌生长需一定光照强度，但并非光照强度越大光合菌生长越好，光照强度有一合适的范围。另外，从图1中可看到发酵糟纤维素含量虽与蛋白质含量呈相反的趋势，但趋势步调相似。从本试验来看，光合菌大量生长从外部摄取氮源（每天必须加氨水，调节酸度），能使酒糟纤维素含量相对降低。

当白炽灯瓦数为50 W、灯与糟层距离为30 cm，即光照强度890 Lx时，光合菌转化丢糟可使蛋白质含量处于较高水平，而使丢糟纤维素含量处于较低水平。

2.2 接种量

接种量对发酵糟真蛋白含量和纤维素含量的影响见图2。图2可见，发酵干糟真蛋白含量与纤维素含量也具步调一致的相反走向。当接种量从5%增加至9%时，真蛋白含量从21.0%迅速上升至29.1%，而纤维素含量从17.3%迅速下降至14.4%；当接种量高于9%时，发酵干糟真蛋白含量与纤维素含量均处于平缓区。

当接种量升高时，光合菌应是大量生长，这样导致了发酵干糟中真蛋白含量的升高与纤维素含量的下降。当接种量升高到一定程度时，对最终发酵糟中的光合菌数量影响不大，这时发酵糟中真蛋白含量与纤维素含量均处于较平稳的状态。因此，接种量有一合适的范围，此时光合菌生长数量较大，而又不造成接种量的耗费。

图2 接种量对发酵干糟真蛋白与纤维素含量的影响

因此，可选取9%～11%的接种量作为最佳接种量的参考点。

2.3 醪层厚度

半固态发酵糟厚度对发酵糟中真蛋白含量与纤维素含量的影响可见图3。由图3可见，发酵糟真蛋白的含量是随着醪层厚度的增加而减少、而纤维素含量随醪层厚度增加而增加，但增减的幅度在随醪层厚度的不同区间而不同。如当醪层厚度在1～3 cm时，发酵醪真蛋白含量减少较少，其从31.1%下降至29.7%；醪层厚度再增加至6 cm时，真蛋白含量降至19.0%。同样的醪层变化区间，发酵糟纤维素含量从13.1%平缓增加至14.3%，再剧增至17.9%。

图3 发酵糟层厚度对发酵干糟真蛋白与纤维素含量的影响

光合菌生长需要一定的光照强度。从目前的文献来看，光合菌较适应于液态培养，因为在液态培养过程中，光透过率较大，利于液态内部的光合菌生长。而在固态或半固态培养过程中，因存在大量的固体物会影响光透过率，致使发酵醪层厚度对光合菌生长有较大的影响。促进光合菌在固态与半固态物的大量、快速生长，又要增加实用价值，关键因素之一就是如何使光照方式有利于发酵醪层内部的光合菌生长。

在本试验的条件下，考虑实用价值与光合菌生长两方面的结合，取发酵醪层厚度3～4 cm为最佳厚度参考点。

2.4 料水比

料水比对发酵糟真蛋白含量和纤维素含量的影响见图4。如图4可见，随着料水比从1：7降低到1：12，发酵后丢糟中真蛋白的含量是先上升后下降，粗纤维的含量是先降低后逐渐升高。当料水比为1：10时，发酵糟真蛋白含量达到最高为30.0%，而纤维素含量达到最低为13.8%。

图4 不同料水比对发酵干糟真蛋白与纤维素含量的影响

因此可以推论，在半固态培养光合菌过程中，水量过多或过少都不利于光合细菌生长，有一适宜的范围。水过多可造成水中营养物浓度低，不能满足菌体生长的需求；水过少营养物浓度虽高，但会增加光透过的难度。因此，将料水比1：9～1：10选择为最佳参考点是合理的。

2.5 温度

发酵温度的影响见图5。图5可见，温度对光合细菌的生长具有一定的影响。随着温度的升高，发酵糟的真蛋白含量是先升高后下降的，当温度为30℃时真蛋白含量达到了最高，为29.7%。粗纤维的含量是随着温度的升高呈现出先降低后升高的趋势，在温度为30℃时，粗纤维的含量降到了最低，为14.3%。

光合菌生长有一适宜温度范围，温度太高或太低，都会抑制光合菌的生长。本试验条件下，30℃比较适合光合菌的生长，这与其它有关光合菌研究的文献报道相一致，表明即使培养基成分发生变化，光合菌生长适宜温度却较少变化。

图5 温度对发酵干糟真蛋白、纤维素含量的影响

2.6 发酵时间

发酵时间对发酵糟真蛋白含量和纤维素含量的影响见图6。图6可见，在发酵过程中前3 d发酵糟真蛋白含量增幅、纤维素含量降幅较大，如真蛋白含量从14.5%上升至29.8%，纤维素含量从17.6%下降至14.3%；从第4 d开始到第6 d发酵糟真蛋白与纤维素含量趋于稳定。

图6 发酵时间对发酵干糟真蛋白、纤维素含量的影响

总体来看，在无纤维素酶帮助下，白酒丢糟在光合菌的作用下，有外加氮源，纤维素可再降3%～4%。而蛋白质含量从发酵过程来看，较纤维素含量变化有较强的剧烈上升幅度，应是随着光合菌数量增加而增加，真蛋白含量在前3 d的发酵时间内有近15%的上升。另外，由于光合菌转化白酒糟过程中不断利用氮源，致使发酵糟每天的酸度上升，所以在发酵过程中需每天补加NH3水调节发酵糟酸度利于光合菌生长，从而也给光合菌生长提供了氮源。这样，可选择3～4 d作为最佳发酵时间的参考点。

2.7 正交试验结果

以单因素试验提供的选取点为参考，以表1的因素与水平进行正交试验，正交试验的结果如表2。从水平均值中可以看出最优因素条件组合为A2B2C2D2E2F3，即当光照强度890 Lx（取白炽灯50 W，灯距醪层垂直距离为30 cm）、接种量10%、醪层厚度3 cm、料水比1：10、发酵温度30℃、发酵时间5 d时，发酵干糟真蛋白含量最高。另外，从极差值分析，各因素影响显著性排序为B[接种量，%（w/w）]与E（发酵温度，℃）＞A（光照强度，W）＞ F（发酵时间，d）＞C（醪层厚度，cm）＞ D（料水比，干糟 g：水 g）。

表2 正交试验结果

按以上正交试验结果的最优组合，重新按1.2.1节步骤试验3次，发酵干糟平均营养成分结果如表3。从发酵干糟蛋白（真蛋白30.2%、粗蛋白35.1%）、纤维素、水分、粗脂肪、总磷、灰分等6个含量指标来看，白酒丢糟经过沼泽红假单胞菌的转化后，蛋白含量剧增，已达到草鱼鱼种饲料标准（SC/T1042—2002）中对蛋白的要求。另外，粗纤维含量下降近9个百分点；灰分下降近5个百分点；总磷含量增大一倍；脂肪含量略有上升，这些均显示着酒糟饲用价值的上升。总磷含量增加了一倍多，可能跟白酒丢糟预处理用磷酸调节酸度有关。

表3 干糟营养成分对比（%）（w/w）

总之，白酒糟经过光合菌发酵转化，更加适宜作为饲料，提高了丢糟的饲用价值，为进一步开发出“白酒糟光合菌活性生物蛋白饲料”奠定了重要的基础。当然，扩大光合菌发酵糟在水产养殖中应用的关键因素，还需要进一步降低粗纤维含量；对微量元素、维生素与氨基酸进行分析与调整；研究后处理工艺与饲料应用品质；探讨工业化生产路径等。

3 结论

采用氨水浸泡、纤维素酶降解等原料预处理方式，利用沼泽红假单胞菌厌氧转化丢糟，发酵转化过程中的6个因素都对沼泽红假单胞菌转化效果有影响，当光照强度890 Lx、接种量 10%（w/w）、醪层厚度3 cm、料水比 1：10（干糟 g：水 g）、发酵温度 30 ℃、发酵时间5d时，白酒丢干糟真蛋白含量可达30.2%（w/w）、纤维素含量 13.6%（w/w）、粗脂肪 6.7%（w/w）、粗灰分10.1%（w/w）、总磷1.1%（w/w）、水分含量 10.2%（w/w），提高了白酒丢糟的饲用价值。

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S816.34

A

1001-991X（2011）07-0041-05

张健，宜宾学院生命科学与食品工程学院，副教授，644000，四川宜宾市五粮大道酒圣路8号。

罗辉、张超，单位及通讯地址同第一作者。

刘小彬、谢刚，重啤集团宜宾分公司。

陈泽军，宜宾叙府酒业。

2010-11-21

四川省教育厅资助项目（08ZC002）

（编辑：刘敏跃，lm-y@tom.com）