标准SDS-PAGE图法测定大豆11S抗原蛋白含量的研究

石 慧 梁运祥

标准SDS-PAGE图法测定大豆11S抗原蛋白含量的研究

石 慧 梁运祥

分离纯化获得高纯度的大豆11S抗原蛋白后，以100μg/ml为浓度梯度差，制备100～2000μg/ml浓度的11S抗原蛋白标准溶液，用SDS-PAGE电泳法制得梯度清晰的11S抗原蛋白浓度标准图。将待测定样品SDS-PAGE电泳后，通过与标准图比较可方便读出样品中11S抗原蛋白的浓度C0，并结合运用公式W=2.15×10-5·C0×100%，可快速计算出样品中11S抗原蛋白的含量。该测定方法具有方便、准确、灵敏度高等特点，适合进行大规模样品11S抗原蛋白含量的测定。

11S抗原蛋白；SDS-PAGE；含量；测定

大豆抗原蛋白中11S抗原蛋白含量约为43.6%[1]，是大豆中主要抗原蛋白之一。作为大豆中含量最高的抗营养因子及大豆的主要蛋白成分，近年来在动物饲料的应用上备受关注。但研究主要集中在分离纯化11S抗原蛋白，分解去除抗原蛋白。除了彭楠等[2]用酶联免疫法测定了大豆11S抗原蛋白，11S抗原蛋白的定量测定方法鲜有报道。李成贤[3]总结了大豆主要抗原蛋白的测定方法，实际上大多数是分离纯化法，虽然也可以用于测定，但当抗原蛋白含量较少时，这些方法灵敏度低，甚至不能完成测定，而且批次多时并不方便、快捷，故这些分离纯化法用于测定存在很多问题。本文采用Thanh等方法[4]纯化大豆11S抗原蛋白，并干燥至恒重，制成11S抗原蛋白浓度标准SDSPAGE图，只要把待测样品抗原蛋白稀释到标准图的浓度范围，就可以完成11S抗原蛋白的测定，该法甚至可以检测到含量极微的11S抗原蛋白，快捷、方便，灵敏度高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及试剂

新鲜脱脂生豆粕，购自东海粮油；

蛋白质抽提液：0.03 mol/l的Tris-HCl（含0.01 mol/l的β-巯基乙醇，pH值8.0）。

1.1.2 仪器

粉碎机，80目筛；pHS-3C pH计；CR 21G高速冷冻离心机；DYY-5电泳仪，Eppendorf微量移液器；5415R小型离心机；E2M5AZ真空冷冻干燥机；电热鼓风干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 大豆11S抗原蛋白的分离纯化

将新鲜脱脂生豆粕粉碎，过80目筛，按Thanh等（1976）的方法提纯11S抗原蛋白，将上述纯化的蛋白质冷冻抽真空干燥，再在50℃电热鼓风烘箱中干燥至恒重，-20℃保存备用。SDS-PAGE检测11S抗原蛋白的纯度。

1.2.2 11S抗原蛋白浓度标准SDS-PAGE图的制作

1.2.2.1 11S抗原蛋白浓度标准样品的制备

精确称取40.00 mg干燥的11S抗原蛋白粉末，用蛋白质抽提液配成浓度为C=2 000 μg/ml的初始溶液，再用蛋白质抽提液将初始溶液按100 μg/ml的浓度梯度差进行稀释，获得浓度100～2 000 μg/ml的11S抗原蛋白标准溶液20个。将以上标准溶液瞬时离心混匀，取各标准溶液20 μl，与相同体积的加样缓冲液混匀，沸水浴5 min，冷却后备用。

1.2.2.2 电泳

分离胶的浓度为12%，浓缩胶的浓度为5%，上样10 μl。电泳条件采用稳压方式：浓缩胶电压47～50 V，电泳时间0.5 h；分离胶电压125～145 V，电泳时间2.5 h。R-250染色液染色45 min，脱色液脱色至胶面无蛋白条带处青白明晰。

1.2.3 不同来源豆粕样品的11S抗原蛋白的检测

粉碎待测样品，过80目筛，50℃烘箱中将其粉末干燥至恒重，分析天平精确称量1.000 g，用蛋白质抽提液浸泡，料水比为1：20，摇床中160 r/min，22℃震荡抽提1 h。8 000 r/min、22℃离心15 min，取上清液20 μl，制样、电泳，电泳条件见 1.2.2.2 节。

2 结果与分析

2.1 大豆11S抗原蛋白的纯度检测

图1 提纯的11S抗原蛋白SDS-PAGE图谱

如图1所示，泳道2清晰可见的条带均为11S抗原蛋白的酸性亚基及碱性亚基。电泳图表明，采用Vu Huu Thanh[4]中的方法分离纯化的11S抗原蛋白的纯度很高。

2.2 大豆11S抗原蛋白的标准浓度SDS-PAGE图谱

图2 11S抗原蛋白的标准浓度SDS-PAGE图谱

2.3 11S抗原蛋白含量测定公式的建立

待测样品中11S抗原蛋白的含量可以用以下公式计算：

式中：K——大分子抗原蛋白抽提率（%）；

C0——标准凝胶图不同泳道色带的浓度（μg/μl）；

V0——11S标准凝胶图每个泳道的点样体积（ml）；

V1——抽提未知样品消耗的蛋白质抽提液的总体积（μl）；

Vx——测定时点样体积（μl）；

W1——待测样品的取样质量（μg）；

W%——待测样品中11S抗原蛋白的百分含量（w/w）。

11S抗原蛋白的抽提率大约为93.0%[4]（K＝93.0%），当取样 1.00 g（W1=1.0 ×106μg），抽提液用量20 ml（V1=2×104μl），点样量为10 μl（Vx=10 μl）的条件下，公式修订为：

2.4 不同豆粕样品11S抗原蛋白的SDS-PAGE标准凝胶图法检测结果

不同豆粕样品与标准凝胶图中样品以相同的电泳条件电泳，得到如图3所示图片。

比照图2、图3各泳道色带与标准凝胶图中较接近的色带及根据公式计算出的11 S抗原蛋白含量见表1。

图3 不同豆粕样品的SDS-PAGE图谱

表1 SDS-PAGE法检测不同样品11S抗原蛋白含量

3 讨论

待测样品的色带与标准凝胶图比照时，应选择待测样品中明显降解的酸性亚基或碱性亚基与标准凝胶图中相同的亚基比照。当待测样品11S抗原蛋白浓度太大，应适当稀释，否则结果不准确，如此次检测的广州样品。

SDS-PAGE法测定11S抗原蛋白关键在于抗原蛋白的提取。影响本文提取方法的因素主要为：样品的pH值、离子浓度[3]、抽提温度及抗原蛋白是否热变性。

①一般工厂送检的样品多为酸性，pH值约为3.00～7.00，而11S抗原蛋白在pH值低于8.0时，都有不同程度的沉淀[4]，抽提时很容易与渣一起被离心弃掉，影响检测结果的准确性。故用蛋白抽提液浸泡样品时应修正样品的pH值到8.0。

②有的样品中添加了金属离子或NaCl，导致抽提时离子强度增大，11S抗原蛋白发生沉淀不溶而降低抽提率[6]。需要用蛋白质抽提液反复多次洗涤，每次洗涤将pH值调到4.5，离心。抽提时将pH值修正到8.0，保证抗原蛋白的抽提率。

③样品中抗原蛋白的抽提如果在冬天，应在摇床中保温至22℃抽提，因为11S抗原蛋白为冷不溶蛋白，低温导致蛋白质不同程度的沉淀，4℃时沉淀量达到最大[3]，抽提时也很容易与渣一起被离心弃掉。

④膨化样品或经高温灭菌样品，抗原蛋白不溶于本文提到的蛋白质抽提液。

4 结论

本文纯化得到高纯度的11S抗原蛋白后，以100 μg/ml的浓度梯度差，制备了 100～2 000 μg/ml浓度的11S抗原蛋白标准溶液，并通过SDS-PAGE电泳制成了11S抗原蛋白的标准凝胶图。标准凝胶图的作用为通过对比待测样品凝胶图与标准凝胶图中相同亚基色带的宽度和色深确定待测样品中11S抗原蛋白的浓度。

运用公式 W=C0·（V0V1/VxW1）/K（w/w）·100%，可计算出待测样品中11S抗原蛋白的含量。实际上，待测样品取样通常为1.000 g（W1），处理后得到20 ml（V1）的抗原抽提液，抗原的抽提率K约为93.0%，待测样品电泳上样量通常为10 μl（Vx），标准凝胶图上样量均为10 μl（V0），故公式修订为W=2.15×10-5·C0×100%。从标准凝胶图中读出抗原蛋白的浓度后，通过该公式即可计算出11S抗原蛋白的百分含量。

[1] 郭林英，周小秋，王之盛,等.大豆球蛋白提取物对鲤鱼肠上皮细胞增殖及其功能的影响[D].四川农业大学硕士学位论文，2006.

[2] 彭楠，葛向阳，梁运祥.酶联免疫法测定11S大豆抗原蛋白[J].饲料研究，2006（3）：30.

[3] 李成贤，周安国，王之盛,等.大豆主要抗原蛋白的分离及测定方法的研究[J].大豆科学，2007，26（4）：618-622.

[4]Vu Huu Thanh,Kazuo Shibasaki.Major protein of soybean seeds:A straightforward sractionation and their characterization[J].J Agric.Food Chem.,1976,24（6）:1117-1121.

[5] 韩鹏飞，姜学，马曦.大豆抗原蛋白研究进展[J].中国畜牧业杂志，2009，45（19）：69-72.

[6] 雷继鹏，田少君，李晓霞.分离7S和11S大豆球蛋白的简便方法[J].粮食与油料，2003，6：6-7.

Determination of the 11S antigen content by standard SDS-PAGE figure method

Shi Hui,Liang Yunxiang

High purity of 11S antigen protein were purified from soybean meal and the standard 100～2 000 μg/ml concentration solutions with concentration gradient 100 μg/ml were prepared.Using SDS-PAGE gel electrophoresis method,a standard concentration gradient graph of 11S antigen protein were obtained.By comparing the SDS-PAGE graph of samples to the standard graph,the 11S antigen protein concentration C0of samples can be easily read,and the content of 11S antigen protein in samples could be quickly calculated according to the formula W=2.15 ×10-5·C0·100%.This method is convenient,accurate,sensitive and it's suitable for high-throughput content determination of 11S antigen protein content in samples.

11S antigen；SDS-PAGE；content；determination

S963.73+4

A

1001-991X（2011）07-0057-03

石慧，华中农业大学楚天学院，讲师，430205，湖北省华中农业大学楚天学院望荃楼1039室。

梁运祥（通讯作者），华中农业大学生命科学与技术学院。

2011-02-22

（编辑：王 芳，xfang2005@163.com）