紫云英根瘤菌培养基的选择与优化

陈海荣，郭照辉，刘前刚，刘清术

（湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410009）

紫云英又名红花草，豆科黄芪属植物，主要分布在长江中下游和华南地区，在海拔400～3 000 m的地带生长良好，是一种重要的绿肥、饲料兼用作物。人们发现，根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮体系[1-2]。我国陈华癸和徐明光最先获得紫云英根瘤菌有效菌株[3]。随后，人们对紫云英根瘤菌进行了多方面的研究，发现采用紫云英根瘤菌剂接种能使作物增产20%～30%，效果显著。在初次栽种紫云英的土壤中接种有效根瘤菌是种植成败的重要因素，多年种植紫云英的地区接种优良菌株也能促进地上部分增产[4]。因此，开发一类高效的紫云英固氮菌剂对提高紫云英的产量，增加稻田土壤肥力具有重要意义。根瘤菌接种效果与根瘤菌株的的固氮能力、竞争结瘤能力和活菌数有关。笔者以中慢生华癸根瘤菌13004#菌株为供试菌株，筛选优质高效的培养基，提高根瘤菌的活菌数，以期为根瘤菌剂的生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌 株 中慢生华癸根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，为紫云英中慢生根瘤菌，从中国农科院菌种保藏中心引进。

1.1.2 培养基 YMA培养基：甘露醇 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 6.8～7.0。

SM培养基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，KNO30.5 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（配方同上），混合维生素液1 mL（混合维生素液：硫胺素10 mg/L，烟酰胺 10 mg/L，泛酸钙 10 mg/L，生物素 1 mg/L），pH 6.8～7.0。

63#培养基（中国农科院网站提供）：蔗糖 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，1%H3BO31 mL/L，1%Na2MnO41 mL/L，1%柠檬酸铁 1 mL/L，1%MnSO41 mL/L，pH 6.8～7.0。

TY培养基：胰蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，CaCl21.3 g/L，pH 6.8～7.0。

BSE培养基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（配方同上），豆芽汁1 000 mL，pH 6.8～7.0（豆芽汁配方：500 g鲜豆芽加入1 500 mL水煮沸30 min后，用纱布过滤即得）。

种子培养基：用YMA培养基作为种子培养基。活菌数计数培养基：YMA固体培养基（YMA液体培养基+2%琼脂粉）。

1.2 试验方法

1.2.1 根瘤菌菌株的分离活化、传代、接种和培养在YMA固体培养基平板上分离根瘤菌株，将单菌落接入斜面传代培养作为菌种。然后将斜面的菌种接入种子培养基中，30℃，160 r/min培养18 h。最后按2%的接种量将种子培养基中菌液接种到液体培养基，恒温振荡培养箱内，160 r/min，30℃培养。

1.2.2 根瘤菌在5种培养基中生长情况的测定培养24 h后开始计数，每6 h计数一次。计数采用平板计数法，稀释倍数取107、108、1093个梯度，每个梯度3个平行，取菌落数在30～150个的平板读数，计算3个平板的平均值。

1.2.3 培养基碳源的筛选 以5个培养基中活菌数最高的培养基为母本，进行碳源筛选试验。分别用等量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖及甘油进行试验，培养基其他成分不变。按2%接种量从种子培养基中接入上述培养基，取24、36、48 h 3个时间点进行活菌数测定，选出最佳碳源。

1.2.4 培养基氮源的筛选 确定最佳碳源后，将培养基中的氮源用等量的酵母粉、蛋白胨、大豆粉、鱼粉进行试验，培养基其他成分不变。按2%接种量从种子培养基中接入上述培养基，取24、36、48 h 3个时间点进行活菌数测定，选出最佳氮源。

1.2.5 正交设计优化选定培养基主要成分 对培养基中的碳源、氮源、磷源及MgSO44种主要成分进行L9（34）正交设计试验。培养48 h后，用分光光度计测定其600 nm下的OD值，分析4种物质对根瘤菌的影响度及最佳剂量组合。

1.2.6 验证试验 用1.2.5中得到的最佳培养基与试验中的活菌数最高的培养基进行活菌数比较，验证正交试验结果是否准确。

2 结果与分析

2.1 紫云英根瘤菌在5种不同培养基中生长状况比较

根据 13004#根瘤菌在 YMA、SM、63#、TY 和BSE培养基中的生长情况所测的的活菌数绘制曲线，结果如图1所示。由图1可知，13004#菌株在5种培养基中均能生长，在YMA、63#和BSE培养基中生长速度较快，活菌数较高，但在SM和TY培养基中表现较差。比较3种表现较好的培养基，BSE中豆芽受季节条件限制，不利于生产；63#培养基成本较高，因此，YMA培养基是紫云英根瘤菌13004#菌株较为理想的培养基。

2.2 根瘤菌对不同碳源的利用情况

YMA培养基其它成分不变，碳源分别用等质量的甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖及甘油做对比试验，平板计数法测得24、36和48 h活菌数，结果如图2所示。由图2可知，13004#根瘤菌在甘露醇和蔗糖中生长较好，甘露醇略优于蔗糖，在麦芽糖中次之，在葡萄糖和甘油中成长较差。因甘露醇在生产成本上要远高于蔗糖，故选定蔗糖为根瘤菌培养基碳源。

2.3 根瘤菌对不同氮源的利用情况

确定以蔗糖为碳源后，将YMA中的氮源用等质量的蛋白胨、酵母粉、大豆粉及鱼粉代替，其它成分不变，做对比试验。平板计数法测得24、36和48 h活菌数，结果如图3所示。由图3可知，根瘤菌在以酵母粉为氮源的培养基中生长效果最好，蛋白胨次之，大豆粉和鱼粉的利用效果差。

2.4 正交优化结果

在确定蔗糖、酵母粉分别为碳源和氮源后，对培养基中4种主要成分：蔗糖、酵母粉、K2HPO3、Mg－SO4·7H2O做正交设计试验，以确定最佳组合剂量。正交设计方案及结果如表1所示。由表1可知，13004#根瘤菌株在2号培养基中生长最好，其次为1号培养基，在9号培养基中生长最差。经极差分析，4种培养基成分对菌株生长结果的影响顺序为：蔗糖＞酵母粉＞K2HPO4＞MgSO4·7H2O，培养基最佳剂量组合为A1B2C1D2，即蔗糖10 g，酵母粉3 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。

表1 根瘤菌L9（34）培养基优化正交试验设计及结果

2.5 验证试验

以正交设计得到的A1B2C1D2配方做培养基，与正交试验中生长最好的2号培养基以及原始YMA培养基做对比试验，培养基其它成分以YMA培养基为参考。菌株在培养24、36、48 h用平板计数法测定3种培养基中活菌数，结果如图4所示。由图4可以看出，经过正交试验得到的培养基在24、36、48 h的活菌数均高于其他两种培养基，可以初步判断，正交试验结果准确，得到的新培养基比原始培养基好。

3 总结与讨论

关于根瘤菌培养基的优化问题，不少学者已作过研究[5-8]，但主要集中在大豆和花生等经济作物上，对紫云英根瘤菌的研究相对较少。本试验证明YMA培养基比较适合紫云英根瘤菌13004#菌株。

碳源和氮源利用试验表明，甘露醇和蔗糖是该菌株比较理想的碳源，因甘露醇价格相对较高，选择蔗糖作为碳源，性价比更高；而酵母粉是该菌株优秀的氮源选择。正交试验及活菌数验证得出培养基最佳配方如下：蔗糖 10 g，酵母粉 3 g，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L，pH 6.8～7.0。

选择高活菌数的培养基是生产优质紫云英根瘤菌肥的第一步，保持菌肥中长期高效的活菌数是生产根瘤菌肥的关键。在菌肥的剂型上，固态菌肥保质期长，活菌数较少，易污染程度高；液态菌肥活菌数高，保质期短，交通运输不便，如何把两者的优点有机地结合起来还需要进一步的研究。

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