喉鳞癌caveolin-1和MVD表达及与颈淋巴结转移的关系

黄清丽，皇甫辉，史 敏，靳阳子

山西医科大学第一临床附属医院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鳞癌caveolin-1和MVD表达及与颈淋巴结转移的关系

黄清丽，皇甫辉，史 敏，靳阳子

山西医科大学第一临床附属医院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

目的：探讨喉鳞状细胞癌组织中caveolin-1 mRNA及蛋白的表达和微血管密度（MVD）与颈淋巴结转移的关系。方法：采用免疫组化法检测40例喉鳞状细胞癌组织中caveolin-1、CD34表达，并用半定量逆转录聚合酶链式反应（semi-RT-PCR）技术检测以上组织中caveolin-1mRNA表达水平。结果：不伴颈淋巴结转移的喉癌组（第1组）的caveolin-1 mRNA相对A值为0.450±0.050，伴有颈淋巴结转移的喉癌组（第2组）的caveolin-1 mRNA相对A值为0.701±0.073；caveolin-1蛋白第1组中阳性表达率为25.0%，第2组为65.0%，不论从基因还是蛋白水平，两组相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CD34免疫组织化学染色结果显示第2组的MVD值为30.19±2.60显著高于第1组值 21.34±4.62（P＜0.05）。 喉鳞状细胞癌组织中 caveolin-1 高表达与 MVD 升高呈正相关（r=0.875，P＜0.05），且二者与颈淋巴结转移相关。结论：caveolin-1在喉鳞状细胞癌中的表达可能在肿瘤转移过程中起了重要作用，与肿瘤血管形成关系密切。

Caveolin-1；喉鳞状细胞癌；微血管密度；淋巴转移

颈淋巴结转移是影响喉鳞状细胞癌患者预后的关键因素。近年研究发现肿瘤内血管生成促进肿瘤浸润和转移，在肿瘤血管生成中，caveolin-1发挥重要的作用，但caveolin-1在喉鳞状细胞癌转移中的研究较少。本实验将从基因和蛋白水平探讨caveolin-1在喉癌血管生成和肿瘤转移中的作用，为肿瘤的预防和治疗提供新的临床策略。

1 材料与方法

1.1 材料

选取我科2008年8月～2010年9月期间手术切除的标本，20例不伴有颈淋巴结转移的喉鳞状细胞癌组织（第1组），20例伴有颈淋巴结转移的喉鳞状细胞癌组织（第2组）。所有喉鳞癌患者均为初发，术前均未接受任何放射或化学治疗，每个喉标本在术后立即取材，所取标本切除均经患者及患者家属同意。caveolin-1多抗购自美国Santa Cruz公司，CD34抗体和小鼠二步法检测试剂盒购自中杉金桥公司，SP试剂盒购自博奥森公司，Trizol、逆转录试剂盒 （TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix）和PCR试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学方法 caveolin-1免疫组织化学用SP方法，CD34免疫组织化学用小鼠二步法：常规石蜡包埋，3μm厚切片后，严格按照试剂盒操作说明进行，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。1.2.2 RT-PCR法 ①RNA的提取：从每一个Eppendorf管中分别取0.1 g冷冻组织，在液氮中迅速磨碎，采用Trizol试剂提取总RNA。②RT-PCR：应用逆转录试剂盒，引物序列：caveolin-1 为 5′-ACA TCT CTA CAC CGT TCC CAT-3′，5′-TGT GTG TCC CTT CTG GTT CTG-3′，GAPDH 为 5′-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′，5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′，按说明书操作逆转录合成cDNA第一链，并配成50μl反应体系中，于PCR扩增仪循环32个周期，扩增条件：94℃变性 20 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，GAPDH 为内对照同时扩增。取PCR产物10μl，于2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照记录。caveolin-1和GAPDH的扩增片段分别为206 bp和307 bp。

1.3 结果判定

1.3.1 免疫组化法 采用Olympus光学显微镜观察caveolin-1的表达情况，细胞胞质或胞膜呈棕黄、棕褐色为阳性细胞。按染色强度及阳性细胞数计算评分：a染色强度（0=无色，1=淡黄色，2=棕黄色，3=棕褐色），b阳性细胞数 （0=阳性细胞数0～5%，1=阳性细胞数 6%～25%，2=阳性细胞数 25%～50%，3=阳性细胞数＞50%）。a+b之和即为最后得分，得3～6分者为免疫组化阳性。

MVD计数：在不知临床及病理特征的情况下，在低倍镜下筛选出最高微血管密度区，在放大200倍的视野下记录5个视野的微血管数，取其平均数[1]，管腔径＞8个红细胞直径或有肌层的血管不计数。

1.3.2 RT-PCR法 电泳后用自动凝胶图像分析系统半定量测定caveolin-1各区带的吸光度值（A值），每例标本相对A值为caveolin-1 A值/GAPDH A值。

1.4 统计学分析

统计学处理应用SPSS 15.0统计分析软件，采用χ2检验、t检验，Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Caveolin-1阳性表达主要在肿瘤细胞胞膜和胞浆的棕黄色颗粒中，血管内皮细胞也有表达（图1），CD34阳性的血管内皮细胞胞质呈棕黄色颗粒（图2）。caveolin-1在第2组和第1组中阳性表达率分别为65.0%和25.0%，MVD在第2组和第 1组中表达分别为 30.19±2.60和 21.34±4.62（P＜0.05）。caveolin-1阳性组和阴性组喉鳞癌组织中的MVD分别是27.88±6.04和 20.65±3.97，说明caveolin-1和 MVD 呈正相关（r=0.875，P＜0.05）。caveolin-1mRNA 在第 2 组和第 1 组中的表达分别为 0.701±0.073 和 0.450±0.050（图 3），caveolin-1 mRNA表达增多与颈淋巴结转移具有相关性（P＜0.05）。

3 讨论

喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，伴有颈部淋巴结转移是影响患者预后的重要因素。研究发现肿瘤内脉管系统参与肿瘤转移过程，肿瘤血管不仅为肿瘤细胞快速生长提供养料和氧分，而且增生的新生血管增加了肿瘤进入脉管的机会，从而促进肿瘤细胞的转移[2]。一些研究显示，乳腺癌[3]、大肠癌[4]等肿瘤中，肿瘤内新生血管生成影响肿瘤的侵袭和转移，肿瘤内微血管密度的增加与局部淋巴结转移和预后密切相关。本研究也发现瘤内高表达MVD促进颈部淋巴结转移，与上述观点一致。瘤内微血管生成可能通过以下机制促进肿瘤淋巴结转移：有充足血供的肿瘤细胞迅速增殖，与瘤周形成压力差，促使肿瘤细胞进入瘤周微淋巴管形成淋巴结转移。

caveolin-1是细胞膜上凹陷微区域caveolae的主要结构蛋白，其在肿瘤侵袭[5]和血管生成[6]中起重要作用。Yu等[7]发现caveolin-1的高表达可以促进肺癌的进展和转移。Barresi等[8]研究也发现caveolin-1表达上调与脑膜瘤MVD呈正相关。在对肾透明细胞癌研究中，发现caveolin-1表达上调与肿瘤转移密切相关，并与肿瘤微血管密度（MVD）呈正相关[9]。本研究结果表明，无论在蛋白水平还是基因水平，伴有颈淋巴结转移组caveolin-1表达高于不伴有颈淋巴结转移组，说明caveolin-1的表达与喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移密切相关。

肿瘤的血管生成包括血管内皮细胞增殖、迁移和分化过程。Beardsley等[10]研究发现，caveolin-1具有促进内皮细胞迁移的功能，与血管生成有关。Liu等[11]发现caveolin-1表达与内皮细胞形成管状结构有关：以腺病毒为载体在内皮细胞内高表达caveolin-1，内皮细胞分化成管状结构增加3倍，而降低caveolin-1表达，则管状结构数降低10倍以上。张志波等[12]研究发现caveolin-1基因沉默的人肝细胞癌株SMMC7721条件培养基能显著降低HUVEC中eNOS ser-1177位点的磷酸化表达，从而抑制VEGF介导的eNOS活化引起的HUVEC管腔结构形成。本研究也显示，瘤内caveolin-1表达增高与瘤内MVD表达升高具有相关性，提示caveolin-1可能通过诱导血管生成参与介导肿瘤的侵袭转移。

综上所述，caveolin-1可能与喉鳞状细胞癌血管生成相关，进而促进喉癌侵袭和颈淋巴结转移，但其具体作用机制仍需进一步研究。caveolin-1和MVD可能成为预测喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移的指标。利用caveolin-1抗体阻断喉癌血管生成可能成为抗喉肿瘤侵袭的有效手段之一。

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Relationship among the expression of the caveolin-1 and MVD with cervical lym ph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma

HUANGQingli,HUANGFUHui,SHIMin,JINYangzi
Departmentof Otolaryngology,the First Clinical Affiliated Hospital of ShanxiMedical University,Taiyuan 030000,China

Objective:To study the relation among the expression of the caveolin-1 and microvessel density(MVD)with cervical lymph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC).Methods:The expression of caveolin-1 and CD34 in 40 samples of tumor were detected by immunohistochemical method.The expression of caveolin-1 mRNA in samples of tumor was detected by semi-RT-PCR technique.Results:The caveolin-1 mRNA A of LSCC without cervical lymph nodesmetastasis was(the first group)0.450±0.050,the caveolin-1 mRNA A of LSCC with cervical lymph nodes metastasiswas(the second group)0.701±0.073;the positive rate of the caveolin-1 protein expression in the first group was 25.0%,in the second group was 65.0%,caveolin-1 was higher either atmolecular level or at the protein level in the second group than the firstgroup(all P＜0.05).The expression ofMVDmarked by CD34 in the second group was 30.19±2.60,and in the first group was 21.34±4.62,the expression of MVD in the second group was higher than the first group(P＜0.05).The over expression of caveolin-1 had a positive correlation with a higher MVD and were both related to cervical lymph nodesmetastasis in the 40 cases(r=0.875,P＜0.05).Conclusion:These results suggest thatover expression of caveolin-1may play a very important role in themetastasisof laryngeal squamous cell carcinoma and is closely correlated with angiogenesis.

Caveolin-1;Laryngeal squamous cell carcinoma;Microvessel density;Lymphaticmetastasis

R739.65

A

1673-7210（2011）03（b）-025-03

黄清丽（1985-），女，河北临漳人，硕士研究生，从事头颈部肿瘤方向研究。

皇甫辉，主任医师。

2010-01-04）