西罗莫司对减轻小口径移植血管材料内膜增生的作用

马晓华 ，王学宁 ，张顺业 ，张 勇 ，郭晓亮 ，高 进 ，李天亮

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西省心血管病医院，山西太原 030001

西罗莫司对减轻小口径移植血管材料内膜增生的作用

马晓华1，王学宁2，张顺业2，张 勇2，郭晓亮1，高 进1，李天亮2

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西省心血管病医院，山西太原 030001

目的：将脱细胞联合肝素处理的小口径异种移植血管进一步结合西罗莫司，以观察术后移植血管内膜增生的情况。方法：将脱细胞联合肝素处理的犬颈动脉进一步结合西罗莫司，并分为A组（对照组，脱细胞并结合肝素）和B组（西罗莫司组，脱细胞并结合肝素+西罗莫司处理）两组。取健康家兔16只，随机分为两组（每组8只），利用兔颈动脉旁路移植模型，分别移植A组和B组的血管进行比较。术后分别于1、2、4、8周采血采用HPLC法检测B组移植血管中西罗莫司的含量。术后3个月超声检测移植血管通畅情况，并取血管样本经免疫组织化学和HE染色观察内膜增生程度。结果：B组8周后仍可检测到西罗莫司，且含量呈逐渐降低趋势。术后3个月超声显示，A组部分血管（2/8）斑块形成、管腔狭窄，B组血管无明显狭窄（P＜0.05）。免疫组织化学检测显示，A、B两组血管管壁均可见新生的内皮细胞和平滑肌细胞。HE染色提示，B组内膜增生程度较A组轻[A、B两组内膜/中膜厚度比分别为（1.63±0.04）μm、（0.43±0.04）μm]（P＜0.05）。结论：在脱细胞结合肝素的小口径异种移植血管上进一步结合西罗莫司可以有效减轻内膜增生。

西罗莫司；内膜增生；血管移植；小口径

小口径血管移植常因血栓形成、内膜增生等原因导致移植血管发生狭窄、闭塞。本实验的前期研究中，将犬颈动脉脱细胞结合肝素处理构建出小口径异种血管材料，并移植入兔颈动脉，术后6个月的观察发现移植血管均无阻塞，通畅性较好，但部分血管内发现不同程度的内膜增生，导致管腔狭窄[1]。西罗莫司抑制血管内膜增生的作用已经在冠状动脉药物涂层支架及人工血管得到证实和广泛应用[2-3]，本实验在前期研究的基础上，将脱细胞联合肝素处理的犬颈动脉进一步结合西罗莫司，以观察其抑制血管内膜增生和预防再狭窄的作用。

1 材料与方法

1.1 血管处理

成年犬8只（山西医科大学动物实验中心提供），体重15.4～18.2 kg，热缺血时间小于5min，取双侧颈总动脉长约15 cm。小心浸泡于含抗生素（青霉素钾1 000 U/ml和硫酸链霉素1 000μm/ml）的生理盐水中备用。采用本实验前期研究应用的方法对取下的犬颈动脉进行脱细胞和结合肝素处理[4-5]。处理后的血管分为两组：A组（对照组，脱细胞并结合肝素）和B组（西罗莫司组，脱细胞并结合肝素+西罗莫司处理）。对B组血管进行结合西罗莫司处理[6-7]：将聚丙交酯乙交酯（Polylactide coglycotide，PLGA）和西罗莫司物理混和配制成溶液，用浸涂提拉法将血管材料浸入该溶液中，匀速拉出，反复3次，然后置于室温下干燥直至溶剂完全挥发，此条件下使西罗莫司聚合物均匀结合在血管材料上。

1.2 移植实验

家兔16只 （由山西医科大学动物实验中心提供），体重2.2～3.0 kg，雌雄不限，随机分为两组（每组8只）。利用兔颈动脉旁路移植模型，分别移植A组和B组的血管进行比较。

氯胺酮10mg/kg，地西泮2.5mg/kg，阿托品1.0 mg/kg肌内注射麻醉，耳缘静脉建立输液通路静滴盐酸氯胺酮30μg/（kg·min）维持麻醉。麻醉成功后将家兔仰卧位固定于手术台上，取前正中切口，显露左侧颈总动脉，将移植血管分别与犬颈总动脉的近心端及远心端用8-0 Prolene线做端侧吻合，两吻合口间距约4 cm，结扎吻合口之间犬颈总动脉，使血流仅通过移植血管。术后第1天恢复常规饲养，前3 d肌内注射青霉素80万U预防感染并口服小剂量肠溶阿司匹林片。

1.3 检测指标

1.3.1 西罗莫司的检测 应用陈宏林等[8]报道的HPLC法在第1、2、4、8周测量B组移植血管中西罗莫司的含量。

1.3.2 超声观察 术后3个月将两组兔麻醉后用HP Sonos 4500型超声成像系统（探头频率10MHz）检测移植血管通畅情况。

1.3.3 HE染色及免疫组织化学检测 术后3个月处死动物，经原切口取移植血管标本做如下检测。HE染色：标本以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，垂直于移植血管长轴制成5μm切片，进行HE染色，显微镜下观察内膜和中膜厚度及内膜/中膜厚度比（I/M），取平均值作为标准数值。免疫组化染色：采用常规SP法，以Rabbit Anti-Ⅷ factor、Anti-Beta-Actin作为一抗 （购自北京博奥森生物技术有限公司公司），经过脱蜡至水、灭活、抗原修复、免疫组织化学染色、复染、脱水、封片等过程制成切片，在显微镜下观察。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察

术中观察移植血管弹性好，搏动良好，吻合口无渗血。术后观察3个月，16只兔均成活，无偏瘫，颈动脉搏动良好。

2.2 西罗莫司浓度检测

B组术后1、2、4、8周均可检测到西罗莫司，且含量呈逐渐降低趋势（表1）。

2.3 超声观察

术后3个月发现部分血管内血栓形成，导致管腔狭窄，超声观察A组（对照组）血栓形成率为2/8，B组（西罗莫司组）为 0/8（P＜0.05）。

2.4 HE染色结果

术后3个月观察发现，B组内膜厚度较A组明显降低（P＜0.05），B组中膜厚度较A组差异无统计学意义，B组内膜/中膜厚度比显著低于A组（P＜0.05）（表2）。免疫组织化学显示A、B两组血管可见新生内皮细胞。

表1 HPLC法测定血管壁中西罗莫司的药物浓度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

表1 HPLC法测定血管壁中西罗莫司的药物浓度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

注：与 A 组比较，*P＜0.01

指标 A组B组（周）1 2 4 8峰面积（mAus）浓度（ng/血管）0 0 350.62 948.55*260.12 800.37*140.52 411.59*22.41 62.85*对照品83.16 384.00

表2 移植血管内膜、中膜厚度及内膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

表2 移植血管内膜、中膜厚度及内膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

注：与 A 组比较，*P＜0.05

组别 血管数A组B组8 8内膜厚度（μ m）8 8±6 2 2±3*中膜厚度（μ m）5 4±5 5 1±3*I/M 1.6 3±0.0 4 0.4 3±0.0 4*

3 讨论

冠状动脉旁路移植术（CABG）中自体动、静脉是理想的血管替代物，但材料有限，若患者合并大隐静脉曲张、动脉粥样硬化等都将限制其利用，且患者大多需要3支或3支以上的移植血管，部分还需要2次或2次以上的CABG，自体血管常无法满足需要。本课题组的前期实验[9]将犬颈动脉作为小口径异种血管，采用酶-去污剂法进行脱细胞处理，并结合肝素，实验证实脱细胞彻底，机械性能无明显破坏；将构建的血管材料移植入异种（兔）颈动脉，通过超声观察发现，肝素的结合处理有助于对抗血栓形成，提高血管通畅率。

但部分血管内由于内膜增生使管腔发生狭窄，可能影响血管的远期通畅性，进一步减轻内膜增生成为本实验的主要研究方向。西罗莫司洗脱冠状动脉支架已成功应用于临床，大量研究证实明显降低了支架置入后再狭窄的发生率[2，10]；也有研究将西罗莫司与人工血管结合，动物移植实验显示结合了西罗莫司的人工血管可以有效抑制内膜增生[11-13]。本实验借鉴西罗莫司洗脱支架的方法，使西罗莫司均匀地结合在血管表面，脱细胞后的血管材料呈纤维网状结构，西罗莫司溶液通过血管纤维孔洞渗透血管壁全层。降解实验表明PLGA载西罗莫司的降解时间为3个月左右[6]。

血管壁平滑肌细胞的凋亡与增殖是内膜增生的重要原因。血管内膜增生有三个高峰：①血管中膜平滑肌细胞增生；②血管平滑肌细胞由中膜迁移至内膜；③内膜显著增厚[14]。Poon等[15]报道西罗莫司通过阻止细胞有丝分裂过程中G1期向S期转变，在体外可抑制人和大鼠的血管平滑肌细胞的增殖。它与胞质受体FK506结合蛋白FKBP12结合，特异性作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），使mTOR羧基末端发生磷酸化反应，失去分解活性，阻断细胞周期G1期向S期的转变，抑制细胞增殖和迁移。西罗莫司通过上述机制抑制血管内膜增生。

本实验借鉴西罗莫司洗脱冠状动脉支架的原理和技术，创新性地将西罗莫司结合到脱细胞并联合肝素处理的犬颈动脉上，构建新型小口径异种移植血管材料。在本实验中，在B组1～8周均可检测到西罗莫司，且浓度呈逐渐降低趋势，提示西罗莫司在体内逐渐释放，发挥作用。由免疫组织化学染色可见A、B两组内均有新生的内皮细胞，且A组内膜增生程度大于B组，增生组织主要为新生的血管平滑肌细胞；由HE染色可见，B组I/M显著低于A组。由此可见这种新型血管材料充分发挥了西罗莫司的抗平滑肌增殖与迁移作用及肝素的预防血栓形成作用，两种药物的作用可以相互补充，以达到抑制内膜增生与血栓形成的目的。

在小口径血管移植中，对血管材料进行脱细胞结合肝素、西罗莫司处理后可以减少血栓的形成，降低血管内膜增生，提高血管的远期通畅性，有可能成为小口径血管移植材料的新型来源。

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Effect of Sirolimus on reducing the small diameter of graft intimal hyperp lasia ofmaterials

MAXiaohua1,WANGXuening2,ZHANGShunye2,ZHANGYong2,GUOXiaoliang1,GAOJin1,LITianliang2

1.ShanxiMedical University,Taiyuan 030001,China;2 Shanxi Cardiovascular Hospital,Taiyuan 030001,China

Objective:To observe the effect of intimal hyperplasia,Sirolimuswas integrated in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.Methods:The decellularized and heparinized canine carotid arterieswere further integrated with Sirolimus,and were divided into Group A(Control group,decellularized and heparinized)and Group B(Sirolimus group,decellularized and heparinized+Sirolimus treatment).Sixteen rabbits were randomly divided into two groups (Group A and B,n=8).The grafts of two groups were transplanted respectively into the rabbits,using the rabbit carotid artery bypass graftingmodel.The content of Sirolimus wasmeasured by HPLC at 1,2,4,and 8 week in Group B,respectively.Results:Sirolimus was found in vascular wall of Group B at 8 week after implantation,and the content of Sirolimus declined during the 8 weeks.After 3 months ultrasound showed that plaque formation and vessel stenosis were found in some blood vessels of Group A(2/8),while Group B had no significant vessel stenosis(P＜0.05).Immunohistochemistry showed endothelial cells and smoothmuscle cellswere found in Group A and B.HE stain found that the intimal hyperplasia was lighter in Group B than Group A [thickness ratio of intima tomedia in two groups were (1.63±0.04)μm,(0.43±0.04)μm](P＜0.05).Conclusion:Sirolimus can reduce intimal hyperplasia in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.

Sirolimus;Intimal hyperplasia;Vascular implantation;Small-caliber

R965

A

1673-7210（2011）03（b）-014-03

山西省青年科技研究基金资助项目（项目名称：冠状动脉旁路移植术中新型桥材料的探索；项目编号：2009021042-3）。

马晓华（1983-），男，河北沧州人，毕业于河北医科大学，医学学士，山西医科大学2008级在读硕士研究生；研究方向：心肌保护。

王学宁（1977-），男，山西太原人，毕业于上海交通大学医学院，博士学位，主治医师。

2010-12-30）