手术型高血压大鼠模型的制作及其肾脏ACE、ACE2 mRNA表达变化的研究*

孙 晓 张昭强

(1. 泰山医学院附属泰山医院泌尿内二科，山东 泰安 271000； 2.泰山医学院生理学教研室，山东 泰安 271000)

高血压是我国最常见的心血管疾病，主要表现为体循环动脉血压持续升高，中、晚期多合并心、脑、肾、眼底及血管壁的损害。高血压的形成和发展是多种机制的综合结果，其中肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)在心血管功能、水电解质平衡、细胞生长、组织纤维化等方面都起着十分重要的作用。血管紧张素转换酶I (angiotensin-converting enzyme，ACE)是RAS系统中一个重要的代谢酶。ACE以及血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)受体特异性阻断剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI和angiotensin Ⅱ receptor blocker,ARB)已成为治疗高血压的首选药物。近来发现体内RAS系统存在ACE以外的第二条代谢通路ACE2。新的代谢通路与传统的RAS通路在功能上相拮抗，是现在学科研究的热点及重点问题[1-2]。本实验采用SD大鼠，通过手术制作成为肾血管性高血压大鼠动物模型，分别用依那普利和氯沙坦进行干预治疗，观察在肾性高血压的发生发展过程中大鼠肾脏中ACE/ACE2的mRNA相关表达变化情况，探讨两者之间的相对变化规律，为揭示高血压的发病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

11周龄SPF级雄性SD大鼠32只，体重 (200±20)g，由山东中医药大学动物中心提供。随机分为4组，每组8只，分为：(1)空白对照组，(2)高血压组，(3)依那普利组[依苏10 mg/(kg·d)]，(4)氯沙坦组[科素雅10 mg/(kg·d)]。造模成功3周后3、4组动物开始给药，药物干预6周，采用饮水法给药1次/天。在此期间1、2组动物始终正常喂养，未进行其他额外干预措施。

1.2 大鼠血压的测定

采用ALC-NIBP大鼠尾动脉无创血压测量分析系统，在大鼠清醒状态下以间接法测量大鼠的尾动脉平均动脉压。在购入大鼠1周后至造模期间，造模1周后至给药后6周内，均隔2日测量一次大鼠血压。

1.3 高血压大鼠模型的制作

随机选取28只SD大鼠，通过腹部手术无菌操作，将大鼠左侧肾动脉充分暴露；使用丝线将其不完全结扎，保留直径约0.7 mm的孔隙，术后分层缝合；使用青霉素40万单位/只抗炎。术后采用尾动脉无创测量法测定大鼠血压，确定造模效果。

1.4 RT-PCR检测大鼠ACE、ACE2 mRNA的表达

心脏取血处死大鼠后，迅速取左肾组织，液氮研磨后；加入Trizol试剂(Invitrogen)，采用氯仿-异丙醇法提取总RNA；1.5%琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量，紫外分光光度计测定其纯度及含量。以总RNA、oligo(dT)18、dNTPs及M-MLV(Promega)等为原料，以25 μl反应体系，常规方法合成cDNA第一链。以大鼠的GAPDH mRNA为内参照。各对引物序列：ACE上游引物：5’-TAACTCGAGTGCCGAGGTC-3’，下游引物 ：5’-CCAGCAGGTGGCAGTCTT-3’；ACE2上游引物：5’-CTTCAGCACTCTCAGCAGACA -3’，下游引物：5’- CAACTTCCTCCTCACATAGGC -3’；GAPDH上游引物：5’-CTGCCATTGCAGTGGCAAAGTGG-3’，下游引物5’-TTGTCATGGATGACCTTGGCCAGG -3’。PCR反应体系组成：PCR buffer10 μl,Mg2+5 μl，dNTPs 4 μl，Taq polymerase 1 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各2 μl (10 μmol/L)，用灭菌去离子双蒸水补足至终体积50 μl。各引物的PCR反应条件等参数见表1。

表1 各引物PCR循环数、产物长度及温度等条件

预变性 94℃ 5 min；变性 94℃ 30 s；退火 58℃ 30 s；延伸 72℃ 30 s；终末延伸 72℃ 10 min。

PCR结束后，每管各取8 μl PCR产物加入6×溴酚蓝上样缓冲液混合后，上样于1%琼脂糖凝胶上进行稳压电泳，电压9 V/cm。电泳25～30 min后，在Quantity one凝胶成像分析系统中进行观察，拍摄电泳图像测定各条带IOD值。以GAPDH表达量为基准，计算ACE及ACE2 mRNA表达的相对量。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 手术及用药后各组大鼠血压变化(表2)

造模后高血压组、依那普利组及氯沙坦组平均动脉压都较造模前及对照组明显升高(P<0.05)，说明手术造模成功。依那普利组及氯沙坦组用药后血压皆有下降(P<0.05)，说明两种药物已达到降压效果。

表2 各组大鼠造模前后血压变化

注：a,b,cP<0.05vs对照组及造模前，b,cP<0.05 vs 给药后。

2.2 各组大鼠肾脏中ACE、ACE2 mRNA的表达

将各组ACE、ACE2及GAPDH的mRNA的电泳图像经Quantity one做灰度分析比较后，发现与正常对照组的SD大鼠相比，高血压模型组大鼠ACE mRNA的表达明显升高(P<0.05)，ACE2 mRNA的表达明显降低(P<0.05)；依那普利治疗组ACE mRNA的表达明显升高(P<0.05)，ACE2 mRNA的表达升高(P<0.05)；氯沙坦治疗组ACE mRNA的表达未有明显差异(P>0.05)，ACE2 mRNA的表达却明显升高(P<0.05)。高血压组、依那普利治疗组及氯沙坦治疗组之间的ACE mRNA、ACE2mRNA表达有差异(P<0.05);高血压组ACE mRNA表达较高，氯沙坦治疗组ACE2 mRNA表达较高(图1，2)。

图1 各组肾脏ACE mRNA表达情况分析

图2 各组肾脏ACE2 mRNA表达情况分析

3 讨 论

高血压是多因素形成的疾病，为了更好的研究高血压，我们需要使用适当的稳定的动物模型。现今高血压的动物模型主要包括3类：自发性高血压、诱发性高血压和基因工程高血压动物模型[3]。本实验通过大鼠尾动脉无创测压技术的检测发现，结扎后动物皆出现血压升高。综合各方面考虑，本实验所采用的大鼠左侧肾动脉结扎所致的肾性高血压动物模型，手术操作简单，成功率高，经济成本较低，应用较为广泛，是一种较为理想的高血压实验动物模型。

RAS是一个复杂的调节系统，在哺乳动物维持血压稳态以及水、电解质平衡中发挥着重要的作用。ACE是RAS系统里一个重要的代谢酶。ACE以及AngⅡ受体特异性阻断剂已经成为治疗高血压和心力衰竭的首选药物[4]。近来发现体内RAS系统存在ACE以外的第二条代谢通路。此条通路通过ACE2生成Ang(1～7)，Ang(1～7)的生理活性与AngⅡ相反，可舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖和心肌纤维化等，在体内有着与AngⅡ相拮抗的生物学效应，是维持心血管系统正常功能的主要调节因子，也是现在医学的研究热点问题[2]。新的代谢通路与传统的RAS通路在功能上相拮抗。ACE2代谢通路的发现为RAS系统的研究、高血压及心血管疾病发病机制的研究和新药开发等开辟了全新的领域[5-6]。

ACE、ACE2与高血压之间存在着密切联系，但具体的作用机制还不是十分清楚。本实验分别用依那普利和氯沙坦进行干预治疗，观察在肾性高血压的发生发展过程中大鼠肾脏中ACE/ACE2的mRNA表达变化情况，为进一步研究肾性高血压的发病机制提供参考。依那普利属于ACEI类药物，氯沙坦属于ARB类药物。研究者发现ACEI和ARB治疗可增加机体中Ang(1～7)的含量，并认为这是相关药物的作用机制之一，但两类药物的作用机制不尽相同。ACEI抑制了ACE的活性后通过负反馈的途径引起ACE mRNA的表达，这一点已经被证实[7]。本研究也同样发现经依那普利治疗的大鼠肾脏ACE mRNA表达增加，同时本研究还发现该治疗组ACE2 mRNA的表达亦有轻度增加。由于ACE2与ACE蛋白结构的差异，ACEI并不能直接影响ACE2的活性，但有实验发现AngⅡ会下调ACE2 mRNA的表达，任何影响AngⅡ的途径均可影响ACE2 mRNA的表达[8]。ACEI对ACE2的表达的具体影响机制还需后续研究进一步证实。ARB通过竞争性结合AT1受体，减少了AngⅡ的结合，引起AngⅡ的增加，为ACE2提供更多的底物，可能通过反馈途径增加ACE2的表达[9]，本研究也观察到了氯沙坦治疗组ACE2 mRNA表达量的增加，具体机制还需进一步研究证实。

本研究发现，手术型高血压造模组同时存在着ACE mRNA的高表达及ACE2 mRNA的低表达。由于 RAS的过度激活是引起机体整体血压水平升高的病理生理学机制之一，而ACE2的生理学活性与ACE互相拮抗，故我们可以推测高血压大鼠组织和器官中低表达的ACE2可能不足以对抗过度激活的ACE的活性；ACE2的低表达在高血压的发生、发展过程中可能发挥了一定的作用，但这一现象究竟是病因还是结果，或者它与高血压的进展是否为相互促进的关系，目前的研究结果尚不能得出明确的结论。

通过现阶段的研究，我们认为这两种酶表达失衡可能在高血压的发病机制及相关靶器官的损害过程中发挥重要作用，但具体的作用机制还有待进一步的探讨。而使用依那普利及氯沙坦为代表的治疗高血压的ACEI和ARB类药物，有助于在不同程度上平衡ACE及ACE2表达的这种失衡，从而能纠正血压的升高，进一步改善相关靶器官的损害，是非常有效的治疗手段。

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