HPLC法测定阿托伐他汀钙的血药浓度*

2011-01-24 00:45孙成龙韩衍银齐永秀
关键词:丹皮汀钙离心管

梁 浩 孙成龙 韩衍银 李 珂 齐永秀

(泰山医学院药学院,山东 泰安 271016 )

阿托伐他汀钙(Atorvastatin Calcium),又名立普妥,为羟甲基戊二酸单酰辅酶 A(HMG-CoA)还原酶选择性抑制剂,通过抑制HMG-CoA还原酶和胆固醇在肝脏的生物合成而降低血浆胆固醇和脂蛋白水平,并能通过增加肝细胞表面低密度脂蛋白(LDL)受体数目而增加LDL的摄取和分解代谢。阿托伐他汀钙能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平,减少低密度脂蛋白的生成。临床上用于家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症等症。随着阿托伐他汀钙临床应用越来越广,联合用药越来越多,对阿托伐他汀钙的研制和开发也越来越受到重视。目前,对阿托伐他汀钙的临床联合用药研究较多,而用高效液相色谱法测定其血药浓度的研究相对较少。本实验建立一种快捷、高效、高选择性测定阿托伐他汀钙血药浓度的高效液相色谱法,对深入研究阿托伐他汀钙的药动学规律,指导临床合理用药以及联合用药具有重要意义。

1 仪器与试药

LC-10AT高效液相色谱仪(SPD-10A检测器、N2000双通道色谱工作站、手动进样器,日本岛津公司);GR-202电子分析天平(日本AND公司);XW-80A型微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);TGL-16G飞鸽离心机(上海化工机械厂有限公司);PHS-29A酸度计(上海精科科学仪器有限公司);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

阿托伐他汀钙对照品(批号:100590-200802,规格:100 mg,中国药品生物制品检定所); 丹皮酚对照品(批号:110708-200506,规格:200 mg,中国药品生物制品检定所);乙腈,色谱纯;甲醇,分析纯;高纯氮气;重蒸水。

Wistar大鼠,购自山东大学实验动物中心,标准颗粒饲料常规喂养。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

高效液相色谱仪(日本岛津公司),C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈:醋酸铵(冰醋酸调节pH至4.0)(50︰50)作流动相,流速1.0 ml·min-1;检测波长246 nm;柱温,室温。

2.2 药品与试剂的配制

2.2.1醋酸铵缓冲液(pH=4)的配制 精密称取醋酸铵0.7696 g,置于500 ml烧杯中,加入重蒸水500 ml,冰醋酸调节pH为4,混合膜(0.45 mm)抽滤。

2.2.2阿托伐他汀钙对照品储备液的配制 精密称取阿托伐他汀钙对照品适量,置于25 ml容量瓶中得阿托伐他汀钙对照品储备液(100 μg·ml-1);精密量取阿托伐他汀钙储备液1 ml于10 ml容量瓶中,甲醇定容得阿托伐他汀钙储备液A(10 μg·ml-1);精密量取阿托伐他汀钙储备液A(10 μg·ml-1)1 ml于10 ml容量瓶中,甲醇定容,得阿托伐他汀钙储备液B(1 μg·ml-1)。

2.2.3内标溶液的配制 精密称取丹皮酚适量,置于50 ml容量瓶中,加甲醇定容,得内标溶液10 μg·ml-1。

2.3 空白血清的制备

取常规饲养的健康Wistar大鼠,尾尖取血,自然凝血后,离心分离血清备用。

2.4 样品预处理

取待测血清100 μl置于离心管中,准确加入10 μg·ml-1的丹皮酚500 μl和需求量的阿托伐他汀钙储备液A或B,涡旋3 min,离心10 min(12000 r·min-1),取上清液移至另一离心管中,氮气吹干,残余物100 μl甲醇复溶,取20 μl进样。

2.5 方法的专属性

取空白血清和含有阿托伐他汀钙及内标的含药血清,按“样品预处理”方法处理,分别取经处理的空白血清和含药血清各20 μl进样,记录色谱图,结果见图1。阿托伐他汀钙的色谱峰保留时间为9.58 min,丹皮酚的色谱峰保留时间为7.68 min,两者完全分离。血清内源性物质对阿托伐他汀钙和丹皮酚的色谱峰无干扰。

A

B

2.6 系统适用性与最低检测限

按阿托伐他汀钙的色谱峰计算,理论塔板数为3700。阿托伐他汀钙与丹皮酚的分离度为3.20,丹皮酚与相邻血清内源性物质峰的分离度为5.21,两分离度均大于1.5(中华人民共和国药典规定)。当S/N=10时,阿托伐他汀钙的最低检测限是0.25 μg·ml-1。

2.7 标准曲线与线性关系

取7支标准刻度离心管(1 ml),分别标号为1、2、3、4、5、6、7,精密移取10 μg·ml-1阿托伐他汀钙储备液250 μl、100 μl、50 μl于1、2、3号离心管中;精密移取1 μg·ml-1阿托伐他汀钙储备液250 μl、100 μl、50 μl、25 μl于4、5、6、7号离心管中,然后依次加入10 μg·ml-1丹皮酚500 μl和血清100 μl,甲醇定容至1 ml,混匀,配制成含阿托伐他汀钙浓度依次为25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25 μg·ml-1,按“样品预处理”方法处理,各取20μl进样,记录色谱图,计算阿托伐他汀钙与丹皮酚的峰面积比Y,以Y为纵坐标,阿托伐他汀钙浓度X为横坐标作图,计算回归方程Y=1.215X+0.0351,r=0.9951(n=7),表示在0.25~25 μg·ml-1范围内,阿托伐他汀钙浓度与峰面积比线性关系良好。

2.8 方法回收率试验

精密移取阿托伐他汀钙储备液适量于1 ml离心管中,配制低、中、高3个浓度(0.1 μg·ml-1、1 μg·ml-1、10 μg·ml-1)的血清样品各3份。照样品预处理方法处理,取20μl进样,记录色谱图,得相应的峰面积比As(H)/Ai(H);另取阿托伐他汀钙标准液,用流动相稀释成相同浓度的阿托伐他汀钙对照品溶液各3份,照样品预处理方法处理,取20μl进样,记录色谱图,得相应的峰面积比As(D)/Ai(D)。按提取回收率=[ As(H)/Ai(H)]/[ As(D)/Ai(D)]x100%计算,低、中、高3个浓度样品的提取回收率分别为91.3%、89.8%、87.1%。

2.9 精密度试验

将阿托伐他汀钙浓度为0.1 μg·ml-1、1 μg·ml-1、10 μg·ml-1的含药血清照“样品预处理”方法处理,在1d内重复测定3次和3d内重复测定3次,以测定方法的精密度。结果见表1。

表1 方法精密度试验结果

3 讨 论

3.1 色谱条件的选择

在色谱条件的选择过程中,重点对流动相组成进行了筛选和比较。确定选用乙腈-醋酸铵(50︰50)作流动相,在该色谱条件下,丹皮酚、阿托伐他汀钙分离完全,色谱峰峰形对称,理论塔板数高,丹皮酚与阿托伐他汀钙的保留时间分别是7.68 min和9.58 min,均在10 min以内,样品测定周期较短,且在此色谱条件下,血清中内源性物质出峰集中在1~3 min,对内标和药品峰无干扰。表明本方法具有专一性强和快速的特点,适合于阿托伐他汀钙的血药浓度检测。

3.2 内标物的确定

以乙腈-醋酸铵(50︰50),调节pH为4作流动相,丹皮酚标准物质在此条件下峰形较好且保留时间适中[7],故选丹皮酚作内标物,具有性质稳定、回收率高的特点,能满足样品测定的需要。

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