乙型肝炎病毒X蛋白对细胞凋亡的影响存在剂量依赖性

翟露露，刘晶，谢幼华

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

目前全世界有3.5亿乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者[1]，深入研究HBV相关疾病的致病机制仍然任重而道远。HBV属嗜肝DNA病毒科，其基因组为部分双链环状DNA。HBV DNA共有4个开放读码框架(open reading frame，ORF)，分别为表达外膜蛋白的preS/S基因、表达核心蛋白及e蛋白的C基因、表达聚合酶的P基因以及表达X蛋白的X基因[2]。

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV表达的唯一非结构蛋白，大量研究提示其在病毒感染、复制、致癌等过程中可能发挥重要作用。HBx全长154个氨基酸，相对分子质量约17 000。HBx在肝细胞中的亚细胞定位也存在争议，在细胞核或胞质中存在HBx均有报道[3-5]。在细胞内，HBx具有广泛的生物学功能，可通过与多个细胞内转录因子如激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、AP-2、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、 CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)、转录激活因子(activating transcription factor，ATF)/cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等相互作用，调控众多细胞基因的转录；另一方面，HBx又可与多条信号转导通路中的关键因子作用，从而影响细胞周期、细胞凋亡和自吞噬等多种生理过程的正常进行[6]。

研究HBx对细胞凋亡的影响可为探索HBV相关的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)致病机制提供更多依据。但目前不同的实验室存在不同的研究结果。有报道称HBx可通过调节肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas、P53或转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等发挥促凋亡的生物学功能[7-10]；而另一些实验室发现，HBx可通过调节线粒体通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore)等途径达到抑制凋亡的作用[11-13]。HBx对细胞凋亡的不同影响可能由2个原因造成，一是不同研究使用的细胞模型不同；二是HBx的表达水平不同。近来Bouchard等报道，HBx可在同一细胞模型中既促进凋亡又抑制凋亡，不同的效应与NF-κB活性的不同有关[14]。本研究中，我们发现HBx对细胞凋亡的双向作用可能与其表达量有密切关系。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株Huh7、人胚肾细胞株293T均由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1质粒构建pc-Flag-X及pc-Flag-X-GFP由本实验室提供，其中HBx编码序列位于Flag标签序列的下游，原始克隆载体均为pcDNA3.1(Invitrogen公司)。表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed2-C1购自Clontech公司。

1.2.2细胞培养与转染Huh7、293T细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.03%谷氨酰胺)中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞以1×106个/皿传代于60 mm培养皿中，12 h后将脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)以2 μl脂质体∶1 μg质粒的比例与质粒混合，加入不含血清的DMEM培养液中，8 h后换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。

1.2.3AnnexinV-FITC检测Annexin V-FITC检测试剂盒购自BD Biosciences公司(BD PharmingenTM)。转染48 h后收集细胞，用预冷的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次；用0.5%胰酶消化，1 ml DMEM培养液吹匀后形成单细胞悬液。凋亡检测相关操作严格按照试剂盒说明书，最后于流式细胞仪中上样分析。

1.2.4线粒体和胞质分离实验主要采用线粒体分离试剂盒(购自普利莱基因技术公司)进行线粒体分离。消化细胞后，加入1.5 ml冰预冷Mito-Cyto Buffer，用间隙严密的研杵研磨细胞30次，4 ℃、800g离心5 min，收集上清液，并转移至新的离心管。4 ℃、12 000g离心10 min，上清液含胞质成分，线粒体沉淀在管底，用50 μl Mito-Cyto Buffer 重悬线粒体。测定蛋白浓度后加入2×Loading Buffer，煮沸5 min，-20 ℃保存。

1.2.5免疫荧光检测细胞转染48 h后，用3.7%聚合甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100作用10 min，含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Tween-20的PBS(PBST)封闭30 min。用含抗NF-κB抗体(1∶200稀释)的PBST封闭2 h，PBST洗涤后用标记有红色荧光的二抗(goat anti-rabbit IgG；Invitrogen公司)孵育1 h，PBST洗3次。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，封片剂封片，显微镜下观察。4 ℃避光保存。

1.2.6蛋白免疫印迹检测样品于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)梯度胶中电泳分离后，于转膜槽中将蛋白转移至硝酸纤维素膜；在含5%脱脂奶粉的PBST中阻断1 h，一抗4 ℃结合过夜或室温结合2 h，二抗于室温结合1 h。压片，显影。其中抗Flag鼠单克隆抗体购自Sigma公司，抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)兔多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，抗细胞色素C鼠单克隆抗体购自BD公司，抗NF-κB兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

2 结果

2.1 不同转染量的HBx在Huh7细胞中发挥的促进凋亡或抑制凋亡作用

2.1.1AnnexinV-FITC结果结果显示，在细胞中转染较高剂量(>4 μg/60 mm培养皿)的质粒DNA时，无论Huh7还是293T细胞的凋亡数量都明显升高，这为研究HBx的表达量对细胞凋亡的影响提供了一个可用的系统。

将不同量的HBx表达质粒转染Huh7细胞，同时共转染表达DsRed的质粒，每个转染的质粒总量通过加入克隆载体pcDNA3.1而调整到相同数量(8 μg)。流式细胞仪分析显示(图1)，在表达DsRed的细胞中，随着HBx质粒转染量的增加，凋亡细胞数量先减少、后增多。在0.25 μg、0.5 μg转染量时，细胞发生凋亡的比例逐渐降低。当转染量逐渐增大到1 μg、2 μg、4 μg时，凋亡细胞比例逐渐上升，甚至超过初始水平。提示转染低剂量HBx表达质粒可一定程度抑制细胞凋亡，而转染较高剂量反而促进细胞凋亡。

Huh7 cells were transiently transfected with pc-Flag-X and DsRed-C2 at different concentrations. Flow cytometric detections were performed after staining cells with Annexin V-FITC. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed.

图1AnnexinV-FITC检测验证HBx对Huh7细胞凋亡的影响存在剂量依赖效应

Fig.1Dose-dependentinfluenceofHBxonHuh7cellapoptosisdetectedbyAnnexinV-FITCstaining

2.1.2半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解体检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是检测细胞凋亡的重要标记物，不论是内源性还是外源性凋亡都会引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 降解激活，所以可通过检测其降解体(cl-cas3)的水平来跟踪细胞凋亡情况。如图2所示，当HBx表达质粒转染量为0.5 μg时，cl-cas3蛋白水平达最低，之后随着HBx质粒转染量的增多，cl-cas3蛋白水平逐渐上升(图2A)。

A: Caspase 3 cleavage. Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X at different concentrations. The cleaved caspase 3 (cl-cas3) levels were detected by Western blot. B: Cytochrome C release. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. Actin and GAPDH were used as loading controls, respectively. One out of two tests is shown in this figure.

图2蛋白免疫印迹法检测转染不同剂量HBx质粒的Huh7细胞中各种凋亡标记物

Fig.2DetectionofapoptosismarkersinHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrationsbyWesternblot

2.1.3细胞色素C自线粒体外漏通常细胞色素C集中在线粒体，但当细胞进入凋亡状态，线粒体膜的通透性发生变化，细胞色素C会从线粒体进入胞质，因此成为检测细胞凋亡的重要标记物。

将质粒转染Huh7细胞后，进行线粒体和胞质分离，吸取胞质，用蛋白免疫印迹法检测胞质中细胞色素C表达水平。结果显示，随着HBx转染量增高，胞质中细胞色素C水平先下降、后上升。在0.5 μg转染量时，胞质中细胞色素C的量降至最低。当转染量逐渐增大到1 μg、2 μg、4 μg时，胞质中细胞色素C的量逐渐增加(图2B)。

2.2 凋亡诱导剂作用下HBx影响Huh7细胞凋亡作用的剂量依赖效应

进一步研究在凋亡诱导剂喜树碱(campothecin)存在时，转染低剂量HBx表达质粒对细胞凋亡的抑制作用。喜树碱是一种重要的抗癌药物，许多实验研究表明其可诱导多种细胞凋亡，作用机制主要是与细胞核内的拓扑异构酶I DNA复合体结合，导致双链DNA发生断裂。

将质粒转染Huh7细胞，24 h后吸去培养液，加入含有1 μmol/L喜树碱的DMEM培养液(1号培养皿除外)；继续培养24 h后收集细胞，进行线粒体和胞质分离，检测胞质中细胞色素C水平。结果显示，在喜树碱作用下，转染低剂量HBx表达质粒时，胞质中细胞色素C水平明显下降，且促进细胞凋亡的HBx剂量比不加喜树碱时显著增高，表现为HBx转染量为4 μg时，细胞色素C的量才显著增多(图3)。

Huh7 cells were transfected with HBx-expressing plasmid at different concentrations. Cells were collected 24 h after treatment with 1 μmol/L campothecin. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

图3凋亡诱导剂喜树碱作用下转染不同剂量HBx质粒对Huh7细胞中细胞色素C含量的影响

Fig.3Dose-dependentinfluenceofHBxoncytochromeClevelincampothecin-treatedHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrations

2.3 不同转染量的HBx对 293T 细胞凋亡存在类似效应

为验证HBx对细胞凋亡存在剂量依赖效应是否是肝癌细胞的特有性质，我们选择胚肾细胞293T，按2.1.1中相同条件进行Annexin V-FITC流式检测，并按2.1.3中相同条件转染质粒后检测细胞质中细胞色素C 的含量。结果显示，在293T中也存在相似结果(图4)。

2.4 不同剂量的HBx 对NF-κB在细胞内分布的可能影响

Bouchard等发现，HBx对细胞凋亡存在截然不同的效应，这一看似矛盾的结果与NF-κB的活性有关。NF-κB只有入核才可抑制细胞凋亡发生，因此我们猜测不同表达量的HBx对细胞凋亡影响的不同作用可能与NF-κB的细胞内分布有关，即HBx的不同表达水平可能影响NF-κB的入核或出核。将pc-Flag-X-GFP质粒梯度转染Huh7细胞，48 h后收集细胞，以抗NF-κB抗体检测，用带有红色荧光的二抗作标记，显微镜下观察。结果发现，NF-κB在不同剂量HBx作用下确实发生了细胞内定位的变化。NF-κB在未表达HBx-GFP时主要位于胞质中，核内几乎没有。当低剂量HBx-GFP质粒转染细胞后，NF-κB入核。HBx-GFP的转染量逐渐增高到4 μg时，细胞核已凝缩成团，而NF-κB在细胞核中分布存在明显空洞(图5)。

A: Annexin V-FITC staining. 293T cells were transfected as that in 2.1.1. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed. B: Cytochrome C release. 293T cells were transfected as that in 2.1.3. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

图4不同转染量的HBx对293T细胞凋亡具有不同的影响

Fig.4Dose-dependentinfluenceofHBxon293Tcellapoptosis

3 讨论

很多文献报道HBx影响肝细胞凋亡的作用，但结果不尽相同，甚至相反。近年来，Bouchard等利用大鼠原代肝细胞进行研究，发现HBx对大鼠原代肝细胞的凋亡存在双向(促进和抑制)作用，且这种双向作用与NF-κB的活性状态有关[14]；但作者并没有对HBx自身的表达水平进行研究以探寻造成上述现象的原因。本研究发现，HBx对Huh7和293T细胞凋亡的双向作用与HBx在细胞内的表达量相关。在原代肝细胞中是否也如此，还有待进一步的研究。

事实上，病毒蛋白对细胞凋亡的双向作用在其他病毒中也有报道。研究发现，腺病毒表达的E1A与E1B蛋白既可促进凋亡又可抑制凋亡，乳头瘤病毒中的E6与E7也存在类似现象。

106Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X-GFP plasmid at different concentrations. Forty-eight hours after transfection, NF-κB P65 was detected by anti-NF-κB and confocal microscopy. The nuclei were stained with DAPI.

图5HBx和NF-κB在Huh7细胞内的定位

Fig.5CellularlocalizationofNF-κBandHBx

由于细胞凋亡会使细胞产生一系列变化，包括染色质聚集、分块以至断裂，形成凋亡小体，线粒体膜通透性改变，内容物外漏，细胞膜外翻等。由于凋亡的发生是极其复杂的生物学现象，所以不能简单通过单一的凋亡标记物来认定细胞凋亡的发生。本研究选择了3种细胞凋亡的检测方法(Annexin V- FITC检测、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解体检测和线粒体内细胞色素C水平检测)，反复确定HBx对细胞凋亡存在双向作用的现象。并且，在胚肾细胞株293T细胞中也得到类似结果，说明这一现象不具备肝癌细胞特异性。

肝癌的发生是一个慢性渐变、积累的过程，其致病因素多样而复杂。在众多诱发因素中，HBV的持续感染发挥着关键作用。在HBV表达的所有蛋白中，HBx在影响病毒感染、复制、致病等过程中发挥重要作用[6, 15]。有研究显示，在HBV相关的慢性肝炎、肝硬化及肝癌患者的肝组织中可检测到HBx持续表达[16-18]，并发现在HBV相关HCC患者的血清及肝组织中检出HBx蛋白的阳性率要远高于慢性乙型肝炎患者[19]。遗憾的是，在患者肝组织中对HBx表达进行定量极为困难。其原因：一方面，编码HBx的0.8 kb mRNA的序列完全与3.5 kb病毒前基因组RNA重叠，无法设计特异性引物来检测HBx mRNA水平；另一方面，HBx蛋白极易被宿主细胞内蛋白酶体降解[20]。目前针对HBx蛋白的抗体仍然存在特异度和灵敏度等方面的不足，导致很难做到定量检测HBx蛋白水平。因此，对自然感染HBV状态下肝细胞中HBx浓度范围的检测，还难以准确定量。

2001年有文献报道，HBx在细胞内的分布可能与HBx的表达水平有关。当HBx极低表达时，HBx集中在细胞核内；HBx高表达时，HBx会在胞质中检测到[3,4]。我们在实验中也发现同样现象(图5)，另外伴随着HBx定位的变化，NF-κB也发生细胞内分布的变化。我们推测，HBx可能与NF-κB存在直接或间接的相互作用。在HBx低表达时，HBx主要集中分布于细胞核，而NF-κB可与之相互结合被带入核中发挥转录调控作用，进而抑制凋亡的发生；当HBx表达量逐渐上升，部分HBx出核，部分NF-κB也随之出核，进而影响其他信号通路，可能拮抗了核内NF-κB抑制凋亡的作用，综合表现为促进凋亡。这一推测还有待深入研究。

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