人类免疫缺陷病毒1型同性恋感染者与健康人群Th17/Treg平衡状况的比较研究

李丹，贾曼雪，梁华，彭虹，刘东华，赵阳，邵一鸣

中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的免疫机制复杂，CD4+T细胞逐渐减少、过度免疫活化及病毒持续存在是其三大重要特征。CD4+T细胞作为HIV感染的主要靶细胞，在HIV感染的发病机制、疾病进展及治疗中起关键作用。

根据细胞分化和功能特征不同，CD4+T细胞最初分为2个功能亚群：辅助性T细胞1(T helper cell type 1，Th1)和辅助性T细胞2(T helper cell type 2，Th2)，分别执行不同的生物学功能。Th1/Th2失衡在HIV感染及发病机制中发挥重要作用，但最近研究发现，Th1/Th2失衡理论并不能完全解释HIV感染的发病机制[1]。辅助性T细胞17(T helper cell type 17，Th17)和CD4+CD25hiFoxp3+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)作为最近发现的2种新的CD4+T细胞亚群，亦是HIV感染的潜在靶标。Th17以分泌白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)而命名，与炎症反应和自身免疫性疾病密切相关[2]。CD4+CD25hiFoxp3+Treg是调节性T细胞家族中最重要的一群，在调节机体免疫反应、维持免疫平衡方面起重要作用[3,4]。两者均来自共同的细胞分化前体，分化、发育调节机制不同于Th1、Th2，且与自身免疫性疾病和感染性疾病的发生、发展关系密切，故其在HIV感染发生、发展中的作用备受瞩目。随着对这2群细胞关系的深入研究，Th17/Treg平衡受到越来越多的认可和关注[5,6]。本研究通过对HIV-1同性恋感染者外周血Th17与Treg比例的检测，探讨Th17/Treg平衡是否发生变化及其与疾病进展的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

根据知情、同意原则，在北京市招募未经抗病毒治疗的HIV感染者54例，平均年龄30.6岁(20～57岁)。均为男男性行为者，经性传播途径感染。采集研究对象静脉血45 ml，EDTA抗凝。所有样本均用Vironostika HIV Uni-Form II plus O诊断试剂盒(Biomerix公司)进行HIV抗体初筛，并用HIV Blot2.2确证试剂盒(GeneLab公司)进行HIV感染的确认。健康对照HIV-1抗体检测均为阴性。HIV感染者及健康对照者的一般情况如表1所示。

表1HIV感染者及健康对照者一般情况

Tab.1CharacteristicsofHIV-infectedpatientsandhealthycontrolsofthestudy

CharacteristicsHIV-infected patientsHealthy controlsCase5432Gender (male/female)54/020/12Age (years)31±732±8Years of infection1.7±1.1-Route of transmissionSexual-CD4+T cell counts (cells/μl)376.2±156.3722.8±190.6CD8+T cell counts (cells/μl)1006.8±368.9539.7±184.8CD4+∶CD8+T cell ratio0.4±0.31.4±0.4Viral load (log10HIV RNA, copies/ml)3.8±0.8-

Values are expressed as mean±SD or number.

1.2 主要试剂

APC-anti-CD3、ECD-anti-CD3、PE-anti-CD4、PerCP-anti-CD8、APC Cy7-anti-CD8、APC-anti-CD25、CD3/CD4/CD45/CD8四色单克隆抗体、红细胞裂解液购自BD公司。FITC-anti-Foxp3单克隆抗体及同型对照、FITC-anti-IL-17A单克隆抗体及同型对照、固定破膜工作液(Foxp3 Staining Buffer Set)均购自eBioscience公司。PB-anti-live/dead购自Invitrogen公司。固定破膜工作液(Fix/Perm A/B液)购自Caltag公司。佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)、蓝菌素A(brefeldin A)购自Sigma公司。磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、RPMI 1640培养基及胎牛血清购自Hyclone公司。淋巴细胞分离液购自Pharmacia公司。病毒载量检测试剂盒由Roche公司提供。

1.3 外周血单核细胞的分离

应用Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入完全RPMI 1640培养液(含有10 g/L谷氨酰胺及100 ml/L胎牛血清)悬浮后，显微镜计数、备用。

1.4 Th17染色

取1×106个PBMC培养于1 ml完全RPMI 1640培养液中，加入PMA(50 ng/ml)/离子霉素(200 ng/ml)/蓝菌素A (5 μg/ml)，阴性管加入等量蓝菌素A，6 h后收集细胞，洗2遍；加入表面抗体后，4 ℃避光孵育30 min，洗2遍；离心弃上清液，加入100 μl固定液(A液)，室温放置15 min，洗1遍；加入100 μl破膜液(B液)及FITC-anti-IL-17A单克隆抗体，4 ℃避光孵育30 min，洗1遍；300 μl 2%甲醛重悬后用FACSAria进行检测。数据用FlowJo软件分析。

1.5 Treg染色

取1×106个PBMC，洗2遍；加入表面抗体，4 ℃避光孵育30 min，洗2遍；离心弃上清液，用1 ml新鲜配制的固定破膜工作液(Foxp3 Fix/Perm)4 ℃避光孵育30 min；离心弃上清液，加入2 ml固定破膜洗液 (Foxp3 Perm buffer)洗1遍；加入FITC-anti-Foxp3单克隆抗体，4 ℃避光孵育30 min，固定破膜洗液洗2遍；300 μl 2%甲醛重悬。以相同方法进行检测和分析。

1.6 CD4+ T细胞计数的检测

取50 μl抗凝全血，加入20 μl anti-FITC-CD3、anti-PE-CD4、anti-PerCP-CD45、anti-APC-CD8四色抗体至TruCount管中，室温避光20 min。加入红细胞裂解液450 μl，立即震荡混匀，室温避光10 min，用流式细胞仪检测。采用MultiSet软件进行分析。

1.7 病毒载量的检测

用Roche公司的COBAS AMPLICOR HIV-1定量检测试剂盒(TaqMan法)在COBAS AMPLICOR全自动聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测仪上定量测定患者血浆中HIV-1 RNA含量，检测低限为40 copies /ml。

1.8 统计学分析

使用SigmaPlot 10.0和SigmaStat 3.5进行统计学分析，计量资料以mean±SD表示，用独立样本配对t检验或Mann-Whitney检验比较组间差异，相关性分析采用Spearman 秩相关检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV感染者外周血中Th17、Treg和Th17/Treg水平

Th17及Treg的流式细胞检测如图1所示。HIV感染者Th17/CD4比例较正常对照显著下降，差异有统计学意义(0.68±0.35vs1.42±0.86，P<0.001)(图2A)。HIV感染者Treg/CD4比例较对照组显著升高，差异有统计学意义(6.15±2.12vs4.50±0.76，P<0.001)(图2B)。HIV感染者中Th17/Treg比例较正常对照显著降低(0.12±0.07vs0.31±0.17，P<0.001)(图2C)。

2.2 不同CD4+ T细胞数水平下HIV感染者外周血中Th17、Treg和Th17/Treg水平

将54例患者根据其CD4+T细胞计数分成3组，其中26例<350/μl，15例350～450/μl，13例>450/μl。<350/μl组的Th17/CD4和Th17/Treg比例最低，Treg/CD4比例最高，与350～450/μl组比较，有统计学差异(P<0.05)。此外，比较<350/μl组与>450/μl组中Treg/CD4和Th17/Treg比例，有统计学差异(P<0.05)(图3)。

2.3 HIV感染者Th17、 Treg和Th17/Treg水平与病毒载量和外周血CD4+ T细胞数的相关性

Th17/CD4比例与CD4+T细胞计数正相关(r=0.371，P<0.05)，与病毒载量不相关(r=-0.183，P=0.184)。Treg/CD4比例与CD4+T细胞计数负相关，与病毒载量正相关(r=-0.402，P<0.05；r=0.447，P<0.001)。此外，Th17/Treg比例与CD4+T细胞计数正相关，与病毒载量负相关(r=0.525，P<0.001；r=-0.318，P<0.05)(图4)。

A: Th17. CD3+CD4+T cell population produces IL-17 after PMA/ionomycin stimulation. Left panel: Anti-IL-17 isotype control; middle and right panels: IL-17 expression in HIV-negative and -positive subjects, respectively. B: Treg. Foxp3-expressing cells were selected from CD4+CD25higate, isotypes for CD25 and Foxp3. The representative flow cytometry images in HIV-negative and -positive subjects were also shown.

图1Th17和Treg的流式细胞分析图

Fig.1GatingofTh17andTreginrepresentativesubjects

Comparison of Th17 levels (A), Treg levels (B), and Th17/Treg (C) between HIV-infected patients (n=54) and healthy controls (n=32).**P<0.001.

图2HIV感染者与正常对照外周血中Th17、Treg和Th17/Treg水平比较

Fig.2ComparisonofTh17,TregandTh17/TreglevelsinperipheralbloodbetweenHIV-infectedpatientsandhealthydonors

A: Th17 levels. B: Treg levels. C: Th17/Treg.*P<0.05.

图3不同CD4+figure_note17、Treg和Th17/Treg水平比较

Fig.3ComparisonofTh17,TregandTh17/TreglevelsinperipheralbloodamongpatientswithdifferentCD4+Tcellcounts

A-C: Correlation between CD4+T cell count and levels of Treg, Th17 and Th17/Treg. D-F: Correlation between viral load and levels of Treg, Th17 and Th17/Treg.

图4HIV感染者外周血中Th17、Treg和Th17/Treg水平与CD4+T细胞计数和血浆病毒载量的关系

Fig.4Relationshipamongplasmaviralload,CD4+Tcellcounts,andlevelsofTh17,TregandTh17/TreginperipheralbloodinpatientswithHIVinfection

3 讨论

研究表明，Th17和Treg来源于共同的初始T细胞，在不同的细胞因子环境下分化而成，具有不同的生物学功能。Th17作为促炎细胞可诱导自身免疫性和过敏性疾病的发生；Treg可介导免疫耐受，发挥免疫抑制作用。Th17与Treg的平衡在维持免疫内环境的稳定中起着非常重要的作用。

Th17是一个新近发现、不同于Th1和Th2的辅助性T细胞亚群，因高分泌IL-17而被命名。除分泌IL-17A外，还可分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等细胞因子，在部分自身免疫性疾病及感染性疾病的发病中起至关重要的作用[7,8]。Th17的反应很可能早于Th1或Th2型免疫反应，出现在感染的早期阶段，诱发组织炎症，并通过细胞因子的诱导，桥接先天免疫和适应性免疫，在炎症后期吸引其他T细胞亚群向感染部位募集。本研究发现，HIV感染者外周血Th17/CD4比例与正常人相比显著降低，并随着CD4+T细胞的降低Th17/CD4比例进一步下降，表明Th17在机体防御中起重要作用。随着HIV感染的进展，Th17/CD4比例下降会导致疾病恶化。HIV感染后Th17减少的原因尚不清楚。已有证据表明，SIVmac251病毒在体内、外实验条件下均可直接感染Th17，可能是Th17减少的原因之一[9]。

Treg与Th17相反，在体内主要发挥免疫抑制作用：上调穿孔素和颗粒酶的表达，选择性杀伤呈递抗原的B细胞，抑制B细胞增殖[10]；诱导抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)产生吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)，分解色氨酸，降低效应性T 细胞活性；下调APC中CD80和CD86表达，干扰其抗原呈递功能[11]。本研究显示，Treg/CD4比例在HIV感染者中显著升高，并与CD4+T细胞负相关，与病毒载量正相关，对疾病进展产生不利影响。可能原因为高水平Treg可抑制HIV特异性免疫应答，使HIV感染者CD4+T细胞数量下降，进一步促进疾病进展[12-14]。部分研究表明，HIV感染中Treg绝对数的变化可能与免疫激活和疾病进展相关[15]，但大多数学者认为Treg作为一群绝对数量较小的CD4+T细胞亚群，可对比例较大的非Treg亚群进行抑制[16]。因此，相比CD4+T细胞绝对数量的下降，Th17和Treg在CD4+T细胞中所占比例变化可更大程度反映它们功能的强弱及对HIV感染进程的影响[5]。

Th17与Treg之间存在复杂的相关性，两者在分化上密切关联，功能上相互拮抗。正常情况下Th17和Treg的功能处于一种精细而复杂的平衡状态，有利于维持机体的免疫稳定状态。因此，较单独研究Th17和Treg而言，Th17/Treg平衡可能在HIV感染中扮演更为重要的角色。我们的研究表明，Th17/CD4与Treg/CD4相反的变化规律导致Th17/Treg比例显著降低，平衡被打破，提示疾病的进展可能与Th17/Treg比例失衡导致的免疫紊乱有关。目前已有学者指出，在致病性猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染动物模型和HIV感染者中，无论在外周血还是在肠道黏膜均存在明显的Th17/Treg比例失衡现象，疾病进展与Th17的选择性减少和Treg的相对水平上升有关[17,18]。Th17/Treg比例失衡可能是导致肠道黏膜屏障破坏、微生物转移和系统免疫激活的重要诱发因素。Favre等更进一步指出，Th17/Treg比例失衡可能与IDO1介导的色氨酸代谢紊乱有关[18]，可促进Foxp3的表达和Treg的产生，并进一步阻碍Th17的产生和分化[19,20]。

Th17和Treg在HIV感染中所起的作用仍存在许多未解之谜。虽然对Th17/Treg比例失衡与HIV感染的免疫病理关系仍需进一步研究证实，但我们相信研究Th17/Treg比例在HIV感染中的进展及其平衡机制将加深对HIV免疫机制的认识，为今后HIV治疗策略和HIV疫苗的研究提供科学依据。

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