人类免疫缺陷病毒1型gp41结构与功能的研究进展

姚茜茜，吕钧，叶荣

复旦大学上海医学院，上海 200032

自1981年首次发现获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)迄今已有30年，该病已成为世界上危害最为严重的传染病之一。截至2009年，已造成3 330多万人感染，1 800多万人死亡[1]。AIDS的病原体——人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)是一种RNA反转录病毒，通过其包膜糖蛋白(envelope glycoprotein, Env)介导，侵入宿主细胞[2]。HIV-1表面的Env为gp120和gp41两个亚单位非共价结合组成的异二聚体，两者由其前体gp160经宿主细胞的蛋白酶裂解产生[3]。HIV-1通过gp120识别细胞膜表面主要受体CD4和辅助受体CC趋化因子受体5﹝C-C chemokine receptor type 5，CCR5)或CXC趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4﹞，并激活gp41发生变构，引起病毒-细胞膜融合，从而进入细胞[4]。HIV-1 gp41通常由345个氨基酸残基组成，分为3个主要结构功能区域：膜外区(ectodomain)、跨膜区(membrane-spanning domain, MSD) 和膜内区(endodomain)。每个区域内含有多个结构域(domain)或基序(motif)，参与不同的生物学功能。膜外区主要与膜融合功能有关；MSD通过疏水作用锚定在质膜上；而膜内区也称为胞质尾区 (cytoplasmic tail, CT)，其功能往往呈现多样化[5](图1、表1)。因此，gp41除与gp120共同参与病毒构成外，在HIV-1的复制与致病过程中也有独特的重要作用。本文对其结构与功能，尤其是膜内区的研究进展进行简要综述。

1 膜外区的结构与功能

gp41膜外区含有一些特殊的功能决定簇，直接参与病毒与宿主细胞融合，同时也是比较活跃的抗原表位区域。gp41膜外区氨基端的16个氨基酸(512～527残基)为富含Gly的疏水性融合肽(fusion peptide, FP)，其在融合过程中的作用已被较好阐明，具有结构多态性[6]。FP在二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO )中为无序结构，在含水缓冲液中形成聚集的α螺旋、β折叠及无序结构的混合体[6]。将十二烷基磷酸胆碱(dodecylphosphocholine, DPC)微粒包埋的FP进行溶液核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)显示，在感染过程中FP最有可能的构象是α螺旋[7]。当脂质双层中胆固醇浓度低时，α螺旋是FP的主要构象，反之则部分转换成β折叠[8]。非融合态的FP包藏在gp120/gp41复合体中，只有gp120与CD4结合后才会短暂暴露[9]。Gly是FP融合过程中构象变化所必需的，促使FP带动病毒蛋白倾斜插入，从而使膜失去稳定性，最终导致膜融合发生[10]。此外，FP下游的13个氨基酸(528～540残基)称为融合肽近侧区(fusion peptide proximal region, FPPR)，其可溶性部分与gp41的近膜外部区(membrane proximal external region, MPER)的可溶性部分在HIV-1感染过程中相互作用，能释放更多的自由能，从而增强Env三聚体的稳定性[11]。

HIV-1 gp41具有典型的I型病毒膜融合蛋白特征，其膜外区有2个七肽重复序列(heptad repeat, HR)，位于氨基端称NHR或HR1(541～580残基)，位于羧基端称CHR或HR2(628～664残基)(图1)。在膜融合过程中，NHR和CHR形成六螺旋束(six helix bundle, 6-HB)，3股NHR螺旋位于中心，3段CHR螺旋以反向平行的方式包绕自身NHR螺旋，形成桶状结构[12,13]。6-HB的形成使FP和MSD向同一脂质双层相互靠近，克服能量阻碍，激活Env复合体形成融合孔，导致细胞脂质双层的稳定性破坏，从而与病毒包膜发生融合[13-15]。6-HB间的疏水作用是影响其稳定性的主要因素，CHR结合在NHR形成的沟槽中[12]。沟槽含有由非常保守的疏水残基构成的深穴核心结构，疏水残基突变会破坏6-HB核心结构的形成[16]。

*The residue numbering is based on HIV-1 HXB2 gp160.

图1HIV-1gp41的结构域

Fig.1DomainsandmotifsofHIV-1gp41

表1HIV-1gp41的主要结构域及其功能

Tab.1FunctionsofthedomainsormotifsinHIV-1gp41

Domains or motifsLength and position*FunctionsReferencesEctodomainFP16 aa (512-527)Membrane fusionSensitive to antibody 4E108, 10, 11, 24FPPR13 aa (528-540)Membrane fusionEnv stability11NHR40 aa (541-580)Epitopes of antibodiesMembrane fusion12-14CHR37 aa (628-664)Epitopes of antibodiesMembrane fusion12-14MPER18 aa (665-682)Epitopes of neutral antibodiesViral infectivity22, 23, 25Membrane-spanning domain (MSD)23 aa (683-705)Env transportation in cellsMembrane fusion26-29, 33, 34EndodomainKennedy22 aa (731-752)Epitopes of neutral antibodies32, 40LLP-226 aa (770-795)Cell-cell fusionSensitive to antibody 4E10Cellular protein interaction24, 44, 45, 48, 56LLP-327 aa (789-815)Interaction with p115-RhoGEFLipid rafts44, 54LLP-129 aa (828-856)CalmodulinViral infectivityEnv assemblyIon permeability Lipid rafts43, 44, 54Y712XXL4 aa (712-715)Env endocytosisEnv assemblyViral polarizationVirus buddingViral infectivity38, 39, 57, 59Cys764,Cys8372 aa (764, 837)Membrane anchoringLipid raftsInfectivityVirus budding39, 41, 48, 49, 60-62Y802W8032 aa (802, 803)Env assemblyEnv transportation42, 49, 57LL855/8562 aa (855, 856)Env assemblyEnv endocytosisEnv intracellular locationViral infectivity38, 39, 42, 59

*The residue numbering is based on HIV-1 HXB2 gp160.

在Env的天然构象中，NHR的沟槽并不暴露，只是在融合过程中短暂出现[17]。HIV gp41核心结构中的“沟槽”和“深穴”是阻断HIV与靶细胞融合的理想靶位，相关的融合抑制剂T-20已被美国食品药品管理局批准上市[16]。

gp41膜外区的MPER由最后18个氨基酸(665～682残基)组成，高度保守、富含Trp残基且不发生糖基化，是HIV-1感染宿主细胞所必需的[18]。用DPC微粒包裹19肽的MPER(KWASLWNWFNITNWLWYIK)，应用NMR发现其呈现α螺旋结构，芳香族和极性氨基酸分布在螺旋轴四周，Tyr、Ser等氨基酸处在同一平面上[19]。MPER的一些疏水性氨基酸残基如Trp666、Trp672、Phe673和Ile675，在HIV和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)的分离株中都十分保守，Ala替换虽不影响细胞与细胞的融合，但会使病毒的感染性大大降低[20]。MPER的5个Trp残基全部突变为Ala，会抑制融合孔扩大及合胞体形成[21]。MPER的衍生多肽能有效渗透到脂质膜中，该区域可能参与病毒破坏脂质膜的过程[22]。有学者认为MPER区能起弯曲gp41分子构象的作用，在融合过程中拉近病毒膜与靶细胞膜的距离[22,23]。此外，MPER也可引起gp41聚集，促进融合孔形成过程中的低聚物形成，参与膜分配[5]。然而，MPER的作用机制目前还不十分清楚，也无合适模型解释其介导的融合过程。MPER含有3种HIV-1单克隆抗体(2F5、Z13e1和4E10)识别的表位，是最具吸引力的疫苗靶位区，这些中和抗体也是研究MPER相关构象转变的有力工具[5,16]。4E10抗体表位特性会随着gp41融合核心区域的结构调整而发生显著变化，如NHR上L568P突变能明显改变MPER序列中4E10相关表位的抗原性和免疫原性[24]。另外，含有6-HB的MPER重组抗原，均能与6-HB及MPER的特异性抗体作用；而且在T569A和I675V突变同时发生时，能显著提高MPER对2F5和4E10的敏感性[25]。

2 MSD的结构与功能

HIV-1 gp41的MSD由23个氨基酸(683～705残基)组成，特别是参与螺旋与螺旋间相互作用的基序GXXXG和位于疏水核心的Arg残基在不同的HIV-1分离株中高度保守，其缺失或突变会抑制Env装配膜融合及病毒的感染性[26,27]。与其他病毒如水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) 的膜蛋白不同，HIV-1 gp41的MSD还含有1个额外的Gly691(GGXXG)，该基序对点突变表现较高的耐受性。G691L突变影响Env装配至病毒颗粒，但改变基序中其他2个Gly的突变株与野生型相比，只会轻微降低融合活性和延迟复制周期[27]。研究发现，3个Gly残基在gp41的MSD螺旋中成簇存在，且在其侧链存在1个氢原子，推测成簇存在的3个Gly可能使GGXXG具有更大的灵活性以适应点突变[27]。当gp41 MSD用VSV G蛋白或血型糖蛋白A或流行性感冒病毒HA蛋白的MSD替换后，病毒的融合活性受到损害[28,29]。然而，重组病毒仍具有复制能力，且这种异源替换也能增强gp160的加工能力[28]。

目前还没有得到gp41的MSD晶体结构，最初的研究结果支持gp41中存在单一MSD[30]。最近有学者提出，gp41中至少存在3个MSD，并且在多个MSD模型中，膜内区Kennedy序列以环状结构存在于膜外[31,32]。在不发生膜融合的情况下，原核和真核2种表达系统均支持单一MSD拓扑学模型；发生膜融合时，真核表达系统更倾向于多个MSD模型[31]。Arg质子化会打破MSD形成的三螺旋束的稳定性，右手螺旋结构中3个保守Arg形成链间氢键，而左手螺旋束中没有，说明三螺旋束在病毒-细胞膜融合过程中促进gp41三聚体形成[33]。计算机模型、动力学和代谢动力学方法研究发现，在亲水脂质双层膜中，MSD以倾斜的、稳定的α螺旋构象存在[34]。在水相，螺旋结构中的Gly残基形成扭曲，导致氨基端前几个残基螺旋解旋。与其他环境相比，脂质环境中gp41的MSD三螺旋束具有更高的稳定性[33]。

3 膜内区的结构与功能

HIV gp41的膜内区比其他病毒的跨膜蛋白长，有151个氨基酸(706～856残基)，含有多个不同的结构域或基序，使膜内区呈现功能多样性。gp41膜内区可促进Env稳定结合于膜上并与细胞膜作用，降低脂质双层的稳定性，改变膜的离子通透性；膜内区也参与调控病毒的复制、颗粒装配和致病过程；膜内区具有诱导原核细胞及真核细胞的溶细胞效应，介导细胞杀伤等功能[35,36]。HIV-1 gp41膜内区典型结构特征是含有3段对水和脂质具有双重亲和性的ɑ螺旋，因其对细胞膜有溶解效应，故称慢病毒裂解肽(lentivirus lytic peptide, LLP)[37]。另外，一些特定的功能基序也存在于膜内区，如与蛋白内吞转运信号有关的Tyr依赖基序Y712XXL和双亮氨酸基序LL855/856[38,39]，可能暴露于细胞表面，能被抗体中和的Kennedy表位[40]，2个参与Env蛋白与脂筏 (lipid raft) 相互作用的、潜在的棕榈酰化位点Cys764和Cys837[41]，以及1个尾连蛋白47(tail-interacting protein 47, TIP47) 作用位点Y802W803[42]。

3.1 gp41CT缺失与点突变对病毒生物学特性的影响

gp41 CT突变、缺失和截短不但降低病毒的复制、感染和致细胞病变能力，而且影响gp160的加工及Env的装配和稳定性，减缓Env的细胞表面内化、病毒颗粒脱壳及与基质蛋白(matrix protein, MA蛋白)的相互作用等[43-45]。一些CT点突变和截短突变会增加HIV-1膜融合能力及Env的表面表达和装配，或改变Env膜外区的生物化学和免疫特性[35]。截去CT能增强Env的中和敏感性，对病毒的免疫逃逸有一定作用[46]；HIV或SIV的CT决定Env特异性装配至病毒颗粒，CT的改变会影响gp120/gp41复合体的稳定性[43]。体外实验证实，gp41的CT缺失会影响病毒在细胞内复制，且与病毒的细胞依赖类型有关[47]。HIV在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中复制需要完整的CT，如CT缺失突变株(HIV-Env-Tr712)复制性病毒传播只发生在MT-4等一些细胞系(称允许细胞)，而在大多数T细胞系如H9细胞和PBMC中不发生复制性病毒传播(称非允许细胞)[36]。另一方面，突变或截短的gp41 CT也能提高病毒膜融合效率，促进6-HB形成，增强Env对6-HB形成抑制多肽的抗性等[16]。gp41 CT的一些点突变会使病毒对一些单克隆抗体及多克隆抗体产生抗性[48]。在感染细胞中，gp41 CT通过与MA三聚体蛋白特异性的相互作用，促进Env到靶细胞 膜上装配与出芽[49]。此外，两性霉素B甲酯(amphotericin B methyl ester)通过抑制病毒进入和病毒颗粒产生而抑制HIV-1复制，但gp41 CT发生突变后产生新的蛋白酶分裂位点，导致HIV对其产生抗性[50]。

3.2 LLP

HIV gp41的LLP-1、LLP-2和LLP-3分别位于828～856残基、770～795残基和789～815残基。这3段序列在不同HIV-1分离株中高度保守，通常亲水性和疏水性氨基酸残基分别位于这些α螺旋的两面。LLP-3与LLP-1和LLP-2不同，其亲水面无带正电荷的氨基酸，而是1个亮氨酸拉链结构[51]。LLP-3中还含有1个富含芳香族氨基酸的区域，有4个Ser和2个Tyr[44]。LLP-1和LLP-2序列中一些Arg高度保守[52]。 通过光诱导的化学反应，LLP-3可插入病毒膜中[51]；LLP-3也能与含有磷脂的人工膜相互作用，诱导脂质体渗漏和聚集[44]。LLP-1与膜结合后插入膜内，亲水面朝内，疏水面朝外，并与磷脂双层结合，形成1个桶状离子通道，称病毒孔道蛋白(viroporin)。该离子通道使带电离子通过，增加细胞膜的电导率，引起膜两侧离子再分布及细胞体积发生变化，最终导致细胞溶解，称“气球样退化”(balloon degeneration)。“气球样退化”与LLP的一些特殊生物功能如广谱抗菌作用及溶血作用有关[51]。此外，LLP-1与钙调蛋白、LLP-3与p115-RhoGEF蛋白羧基端的调控域发生相互作用[53]。圆二色谱(circular dichroism)和傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy)研究表明，LLP-1和LLP-2能使磷脂酰小囊泡释放羧基生物素，使大单室脂质体融合、破裂及引起磷脂混合，并可溶解细菌、真菌、红细胞和各种培养的真核细胞[51]。

LLP-1中一些带电荷氨基酸残基的替换或缺失会影响Env在细胞表面表达，与Env的膜融合、颗粒包装、稳定性及多聚化等功能有关[54]。有些LLP-1突变株发生复制缺陷，其感染性降低85%，与gp41装配至病毒颗粒减少有关[55]。LLP-2是Env免疫原性的关键决定簇，突变的LLP-2与野生型相比，其螺旋结构降低60%[48]。另外，LLP-2发生点突变，使gp41胞外区和gp120构象发生变化，导致Env胞外区与中和抗体的结合率降低，但不影响其CD4和辅助受体结合位点的暴露及病毒的感染性[48]。人工合成的LLP-1及LLP-2多肽，当保守Arg突变为Ala时，蛋白复合受体潜能和膜结合能力都明显下降，推测可能与Arg突变使LLP二级结构由α螺旋变为无规则卷曲结构有关[52]。

HIV或SIV中gp41 CT截短或突变可改变Env的融合性，但涉及的机制仍模糊不清，充满争议。通过细胞-细胞融合实验和在CT不同位点引入终止密码子，证实截去gp41近端至LLP-2这一区域会增加Env的融合效率，并使Env膜外区中CD4诱导的表位暴露。定量融合实验发现这些截短使融合率增加2～4倍，推测原因在于LLP-2限制了Env的膜裂解能力[35]。Kalia 等研究表明，LLP-2中的一些定点突变抑制Env的细胞-细胞融合，对病毒复制没有明显影响[55]。该突变体的膜融合活性降低90%，在T细胞中诱导合胞体形成的能力也受损，但是这种突变与细胞表面Env的表达水平大幅度下降、病毒复制及Env装配的缺陷关系不大[55]。关于这一现象的可能原因是膜融合过程中，位于膜内部的LLP-2短暂暴露至膜外并与6-HB核心结合，从而调节膜融合。此外，LLP-2可被其抗体在融合放慢时捕获，减慢了融合过程，延长了中间过渡态[56]。

3.3 与Env转运和颗粒装配相关的功能基序

膜内区一些胞吞和转导信号与HIV-1的Env蛋白在细胞膜积累、装配以及病毒感染性密切相关[38,39,57-59]。这些信号通过细胞蛋白发挥作用，如Tyr依赖基序(Y712XXL)与细胞网格蛋白衔接蛋白2 (adaptor protein 2, AP-2) 发生相互作用[39,58,60,61]，而双亮氨酸基序(LL855/856)与AP-1结合[62]。

不同细胞中HIV-1颗粒包装的位置不同，如T细胞中包装主要发生于质膜，而巨噬细胞中发生于膜相关细胞器。稳定状态下，病毒感染后Env主要分布于核周围的高尔基复合体反面网络结构(trans-Golgi network, TGN)中[57]。病毒包装前Env进行定向转运，使Env在特定部位的浓度处于最适状态；Y712XXL突变会影响病毒颗粒的装配及其感染性，但两者并不一致，且与细胞类型有关[38]。Y712S突变时，病毒颗粒的装配增加2倍，同时感染性也更强；而Y712C突变时，装配水平降低3/4，感染性却增强[38]。不完整的Tyr依赖基序可使细胞表面Env表达量增加，但没有持续观察到这些突变株中Env的装配增加[59]。Y712XXL信号也依赖gp120。Y712A突变中，gp120在MT4细胞中的装配轻微降低，而在293T细胞中装配水平没有变化。Y712XXL缺失并不能完全阻断Env的内吞作用，只有同时将LL855/856删除才能完全阻碍内吞作用[59]。尽管如此，Y712XXL和LL855/856活性不具有叠加效应。一些以CCR5为辅助受体的嗜巨噬细胞病毒，其Y712A突变并不明显影响感染性或复制率[59]。LL855/856突变为Ala时，在HeLa细胞中Env显示明显的近核区域化，而在细胞质的外围则分散存在[38]。双芳香氨基酸Y802W803与TIP47结合介导Env运输，对有感染能力病毒的形成和Env装配至病毒颗粒非常重要。如在HeLa细胞中，野生型Env分布在近核区域。若Y802W803发生突变，Env则分布在细胞质的小囊泡中[42]。Y712XXL除作为内吞信号外，还与HIV的极化出芽有关[63]。

3.4 膜内区Cys残基及其与脂筏的作用

HIV-1 gp41膜内区有2个相当保守的Cys残基，分别位于LLP-2上游和LLP-1内部(Cys764和Cys837)，参与Env的棕榈酰化和脂筏形成，是病毒出芽、装配所必需的[64]。如将Cys突变为Ala，会消除Env与脂筏的相互作用，并极大降低脂质膜包装，其感染性也只有野生株的40%[41]。然而，也有实验显示该棕榈酰化对病毒复制影响并不明显。如HIV分子克隆毒株pJRCSF的gp41膜内区无Cys残基，但仍有复制能力和感染性[65]。Cys764位置更靠近膜，其棕榈酰化可能有助于该Env锚定到膜上。另有学者则认为，Cys837棕榈酰化占主要作用[61]。此外，LLP-1本身也可能参与脂筏作用，并不一定与Cys有关。LLP-1截短后，Env在脂筏上的定位明显减低。点突变或替换突变也表明，LLP-1的α螺旋结构对Env与脂筏的相互作用疏水面比亲水面更重要[49]。用Pro替换疏水面的残基Val829、Val833和Ile843后，Env的脂筏作用极大削弱；替换亲水面的残基Val832、Ala839和Leu855时，对Env的脂筏作用影响相对较小[49]。

3.5 膜内区与MA蛋白的相互作用

HIV通过Env CT与Gag的相互作用调控病毒装配过程[66]。实验证明，HIV-1 MA蛋白突变会阻断Env包装，而截短或缺失的CT逆转这种包装缺陷；同样，因Env CT突变引起的装配异常也可被MA蛋白突变修正[62]。另外，MA蛋白上的一些突变也会阻碍Env转运至组装位点，如MA蛋白的一些Ser残基突变使MA蛋白的磷酸化降低，严重损害病毒与靶细胞的膜融合及其感染能力，病毒颗粒的gp120装配降低，这些损害可通过膜内区的缺失修复[64]。HIV-1和SIV的Env可指导Gag从极化上皮细胞底外侧释放，其膜内区能与MA蛋白直接作用，由LLP-2碱基缺失导致的Env装配缺陷通过MA蛋白中单个氨基酸的改变会发生逆转[45]。Gag通过自身的加工及与Env 膜内区末端的相互作用限制其融合活性，因而与未成熟病毒颗粒的感染性相关，而CT导致的Gag表达下调可能是调控病毒装配和出芽过程中的一个重要步骤[43]。

Env整合到病毒颗粒中是通过LLP与Gag基质区域相互作用发生的，然而在这一过程中究竟是LLP-1、LLP-2，还是LLP-3的作用，尚有待进一步研究[57]。Hourioux等构建了CT区的一系列多肽，发现742～835多个多肽都能与Pr55Gag颗粒结合，并推测LLP-2及其邻近区域在该过程中起主要作用[67]。Murakami的研究提供了一些MA蛋白与LLP-2相互作用的遗传学证据[45]。Piller等对LLP-1区域进行突变、缺失、替换，发现大部分突变体都对Env的装配有显著影响[68]。Kalia等研究发现，LLP-1突变株的Env装配能力显著下降，而LLP-2突变株则具备完全的Env装配能力[55]。存在于LLP-3中的双芳香氨基酸Y802W803能将Env锚定到TGN，因此LLP-3在Env的装配中也起重要作用[42,69]。

4 展望

HIV-1 gp41膜内区对病毒的复制、装配和致病过程起重要作用，但其功能发挥的确切机制仍不清楚。由于膜内区在结构和功能上不仅与gp41膜外区，还与gp120的结构和功能密切相关，因此对单个结构域的作用很难明确界定[70]。首先，较长的gp41膜内区经常发生代偿性变异，在功能上表现出灵活性。如Env与MA蛋白的相互作用调节HIV-1装配和成熟过程，两者存在明显的诱导性突变倾向，提高病毒装配能力。最近发现，这种Env膜内区变异方式使HIV-2和SIV突变体获得拮抗抑制病毒释放的Tetherin(干扰素诱导的细胞膜蛋白)，从而恢复突变子的致病性[71]。其次，不同结构域或基序相互作用，共同完成Env的膜融合等功能。如果gp41膜内区尤其是Kennedy表位的拓扑结构发生变化，可能会导致MSD和膜内区其他结构域的相对位置和功能改变[31,32,56]。上述进展对了解HIV-1的感染、复制和致病机制，研发新的抗病毒药物提供了一定理论基础。

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