基于FTIR技术和HPLC法的广西不同石山地区两面针化学成分比较分析Δ

郑娟梅，韦文俊，雷欣潮，黄庶识，韦柳花，沈亮

（1.广西科学院生物物理实验室，南宁市 530007；2.广西中医学院，南宁市 530001；3.广西大学农学院，南宁市 530005）

基于FTIR技术和HPLC法的广西不同石山地区两面针化学成分比较分析Δ

郑娟梅1，2＊，韦文俊2，雷欣潮2，黄庶识1#，韦柳花3，沈亮3

（1.广西科学院生物物理实验室，南宁市 530007；2.广西中医学院，南宁市 530001；3.广西大学农学院，南宁市 530005）

目的：研究两面针的红外光谱特征及不同石山地区两面针药材的差异，并结合高效液相色谱（HPLC）法分析广西不同石山地区两面针中生物碱的差异。方法：采集广西不同石山地区两面针药材，制备傅里叶变换红外光谱（FTIR）图，运用主成分分析法（PCA）研究不同谱图间的差异，结合HPLC法测定氯化两面针碱的含量。结果：两面针所处的地理位置、纬度、气候、年降雨量、土壤等外在条件不同，均能使其化学成分的含量存在差异。结论：运用FTIR技术可以快速鉴别出不同石山地区两面针主要化学成分的差异，并能够准确把握药材的整体信息。

两面针；傅里叶变换红外光谱技术；高效液相色谱法；石山地区；氯化两面针碱

两面针为芸香科植物两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根[1]，主要分布于浙江、广西等地，全国各地多有栽培[2]。其主要活性成分为生物碱类，含量约0.7%。主治风湿性关节痛、牙痛、胃痛、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症[3]。红外光谱技术在“指纹”区能快速区别不同的中药材，它可以对中药材全组分进行直接测定，反映制剂整体信息[4～5]。笔者运用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术，结合高效液相色谱（HPLC）法研究两面针的红外指纹特征及其在广西不同石山地区在红外“指纹”区化学成分之间的光谱差异[6]，为建立直接、快速和准确测定两面针有效成分的试验方法，科学评价两面针药材质量提供参考。

1 仪器与试药

Nicolet 5700FTIR仪，包括DTGS/B检测器、CTO-20A柱温箱、CBM-20A工作站（美国Thermo公司）；BT-224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；HW-3A型温控红外烘箱（天津港东科技发展股份有限公司）；HPLC仪，包括LC-20A二元泵、SIL-20A标准自动进样器、SPD-20A紫外-可见检测器、CTO-20A柱温箱、CBM-20A工作站（日本岛津公司）。

两面针药材（干燥根）采于广西南宁、崇左市8个不同石山地区产地，经广西大学农学院黄荣韶教授鉴定为芸香科植物两面针Z.nitidum（Roxb.）DC.；氯化两面针碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111665-200401）；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 FTIR法

样品于55℃干燥48h，粉碎过200目，每个样品作20个重复。各样品称取1.0mg，与溴化钾（碎晶）混合研磨充分，压制成厚度约1mm的锭片，将锭片放入红外光谱仪测定，每个片随机扫3个不同的点，再取其平均谱图作为最后的样品谱图。试验测试条件：光谱范围为4000～400cm-1；光谱分辨率为4cm-1；扫描次数32次。

2.2 HPLC法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：UltimateTM×B-C8（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-（0.2%三乙胺+0.2%磷酸）缓冲液（30∶70）；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：272nm；进样量：10μL。理论板数按氯化两面针碱峰计算应不低于5000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取氯化两面针碱对照品5.60mg，加适量无水乙醇使之溶解并定容于25mL量瓶中，制备成氯化两面针碱浓度为0.175mg·mL-1的对照品贮备液。再精密量取5mL，置10mL量瓶中，制备成氯化两面针碱浓度为88μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取各产地两面针药材粗粉约1g，精密称定，加95%乙醇25mL，回流2次，每次2h，过滤，合并滤液，用95%乙醇定容至50mL量瓶中，摇匀后以1000r·min-1离心，取上清液作为供试品溶液。取10μL注入色谱仪，依法测定。

3 结果与分析

3.1 两面针的红外光谱特征分析

两面针的一维和二阶导数红外光谱图分别见图1A、B。

由图1A可以看出，两面针的红外光谱图是典型的阶梯状图谱，主要分三段：3750～2000cm-1、2000～900cm-1、900～400cm-1。在第一波段范围内出现了2个（组）吸收峰，分别为：3415cm-1处宽带振动，主要是-OH伸缩振动峰和氨基酸中N－H键伸缩振动的叠加；2937cm-1处是一个强的、尖锐的吸收峰，是亚甲基-CH2的对称伸缩振动峰的叠加。此波段可以认为是蛋白质和核酸等物质对光谱的贡献[7]。图1A、B显示，两面针红外光谱图2000～900cm-1波段范围内一维和二阶导数出现了19个（组）吸收峰，此波段应归属为α，β-不饱和酯键、C＝C或芳环骨架振动的叠加峰[8]。在1742cm-1处是五元环酮[ν（C＝O）]的吸收峰；1675、1596、1580cm-1处的3个峰提示有生物碱（鹅掌楸碱）的羰基C＝O存在[9]；1658cm-1处为酰胺的吸收带Ⅰ[ν（C＝O）]，1542cm-1处为吸收带Ⅱ[δ（N－H）]，重叠为宽峰[10]，因此可以指认为酰胺的特征峰；1646cm-1处是C＝C或芳环骨架振动的叠加峰；1596～1466cm-1波段的一组吸收峰为苯环骨架振动峰；1427cm-1附近的一组吸收峰是由C－H的变角振动引起的；1376cm-1处是由-CH3的弯曲振动引起的；1324cm-1处是由芳香胺N-H的弯曲振动引起的；1160cm-1处的肩峰是糖类的C－OH的伸缩振动峰[11]；1160、1032、1081、987cm-1处均有明显的吸收峰，为糖类的主峰；另外，931、861、712cm-1等处均体现出糖类的辅峰。可见，此波段主要是生物碱、酯类、糖类和苷类等物质的特征吸收。第三波段范围内的吸收峰较少、强度较低，主要是分子的骨架振动和变角振动。综上所述，两面针主要含有生物碱、酯类、醇类、苷类、多糖类等化学成分，这跟前人研究结果一致[9]。

3.2 两面针不同产地的红外光谱比较分析

不同石山地区两面针的红外光谱图见图2。

从图2可以看出，不同石山地区两面针的红外光谱的峰位无明显差别，但在1740～1034cm-1波段范围的峰强度却有明显的差异，在1640、1500、1034cm-1处差异最为明显。从两面针红外光谱特征分析可知，在这些波段主要是生物碱、糖类物质的特征吸收。其原因主要是因为样本所处的地理位置、纬度、气候、土壤等外在条件的不同而使两面针化学成分的含量存在差异。

为了提高光谱的特异度与灵敏度，以便更好地寻找广西不同石山地区两面针红外光谱的异同，本研究采用主成分分析（PCA）多元统计方法对广西不同石山地区两面针红外光谱数据进行分析。PCA是利用降维处理技术，将原来多个变量化为少数互不相关的主成分，从而描述数据集内部结构的一种统计分析手段[12]。广西不同石山地区两面针的PCA分析结果分别见图3A～D。

由图3可知，A和C的三维散点图由第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）及第三主成分（PC3）组成，且3个主成分的累积贡献率达99%。在PC2中广西不同石山地区的两面针明显处于不同位置。从图3A中散点的分布可以看出，马山县、崇左市和天等县各自处于相对独立的空间，与其他区域有明显区分；但大新县和宁明县间有部分重叠，宁明县和天等县2个产地样本的点虽然没有重叠，但是相距较近。初步说明马山县、崇左市和天等县的两面针与其他两面针的红外光谱差异较大，而三维中具有重叠部分的不同产地间红外光谱差异相对较小。可见，通过PCA法可以将广西不同石山地区的两面针红外光谱在一定程度上加以区分。

图3B是不同石山地区两面针的PCA中第二主成分的载荷（loading pc2）。从图3B可知，其对应的1624、1575、1490、1324、931、861、787、507cm-1等11个红外峰在PC2中起最关键的作用。此波段主要是糖类物质的特征吸收，所以几个不同产地的样本的差异反映在糖类物质的含量不同，说明本研究中广西不同石山地区糖类物质的含量存在较大的差异。可能是因为大新、宁明、天等3个县是相邻的地处桂西南的边境县，地理位置（纬度）、自然环境、气候条件相似，来自这3个县的样本化学成分、含量相近，导致PCA分析结果中三产地的样本点发生重叠。而崇左市在上述3个县东100多千米处，马山县在其东北300多千米处，地理位置、气候等条件与其有较大不同，使得崇左市和马山县的样本与上述3个县的样本得以较好的区分。

图3 PCA分析结果A.不同产地两面针的PCA分析结果；B.不同产地两面针PCA的loading pc2；C.大新县不同乡镇两面针的PCA分析结果；D.大新县不同乡镇两面针PCA的loading pc2；1.大新县城郊；2.宁明县；3.马山县；4.天等县；5.崇左市郊；6.大新县硕龙镇；7.大新县上古岭；8.大新县榄圩镇Fig3 Results of PCAanalysisA.PCA results of Z.nitidum from different producing areas；B.loading pc2of PCA of Z.nitidum from different producing areas；C.PCA results of Z.nitidum from different towns of Daxin county；D.loading pc2of PCA of Z.nitidum from different towns of Daxin county；1.suburban of Daxin county；2.Ningming county；3.Mashan county；4.Tiandeng county；5.suburban of Congzuo city；6.Shuolong town of Daxin county；7.Shangguling of Daxin county；8.Lanxu town of Daxin county

图3C是大新县不同乡镇样本的PCA三维图。从图3C可以看出，大新县不同乡镇之间的样本在一定程度上有区分，其县城与硕龙镇的样本点部分重叠，上古岭和榄圩镇的样本处于相对独立的空间，更容易区分。

图3D是大新县不同乡镇样本PCA第二主成分的载荷（loading pc2），在1800～500cm-1波段出现了15个（组）存在差异的峰。此波段主要是生物碱和糖类物质的特征吸收，反映了不同乡镇样本化学成分含量的差异。其PCA的负载因子比图3B明显多了1751、1594、1507cm-1等4个峰，因为同一个县不同乡镇的两面针成分差异更小，需要更多影响因子的作用才能使PCA分析结果更明显。同一个县不同乡镇所处的纬度、土壤等外在条件不同，两面针的化学成分含量也不同。

以上PCA分析结果符合实际情况。

3.3 两面针不同产地的HPLC比较分析

从广西不同石山地区两面针的红外光谱比较分析可知，用PCA分析能将不同石山地区两面针的样本在一定程度上进行区分，主要是生物碱和糖类成分的含量存在的差异。两面针总生物碱中氯化两面针碱的含量≥60%[13]，采用HPLC法测定不同产地两面针中氯化两面针碱的含量，结果见表1。

从表1可以看出，同一县不同乡镇氯化两面针碱的含量也存在差异。崇左市所含的氯化两面针碱含量最高，初步认为由于崇左市位于北回归线以南，光热充足，湿润多雨，年降雨量达1200mm以上，全年夏长冬短，作物一年三熟，所以光合作用的强度较其他产地强，净光合速率较快，从而含量明显比其他产地高。大新县城属桂西南岩溶山区，地势北高南略低，地形以岩溶石山为主，气温比其他产地低，其两面针中氯化两面针碱的含量也就明显比其他产地低。可见，不同石山地区两面针的HPLC分析结果与红外光谱分析结果相符合。

表1 不同产地两面针中氯化两面针碱的含量（mg·g-1）Tab1 Content of nitidine chloride in Z.nitidum from different producing areas（mg·g-1）

4 讨论

运用FTIR技术可知两面针主要含有生物碱、酯类、醇类、苷类、多糖类等化学成分。用PCA法在一定程度上可将广西不同石山地区的两面针红外光谱进行区分。不同县的主要差异反映在糖类物质的含量不同；不同乡镇的区分主要反映在生物碱和糖类物质的含量不同。通过HPLC法分析可知崇左市的生物碱含量高于其他县城，而大新县城的生物碱含量最低。同一县的不同乡镇生物碱含量也存在差异。由于样本所处的地理位置、纬度、气候、年降雨量、土壤等外在条件的不同，造成两面针化学成分含量存在差异。综上所述，运用FTIR技术可以快速鉴别出不同石山地区两面针主要化学成分的差异，与HPLC法相比具有无需提取分离，并可以同时测定多种化学成分含量等优点，能够准确把握药材的整体信息，避免了用单一成分来衡量药材质量的优劣，更加符合中医辨证原理。

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Comparative Analysis of Chemical Compositions ofZanthoxylum nitidumin the Karst Region of Guangxi by HPLC and FTIR

ZHENG Juan-mei，HUANG Shu-shi
（Biophysics Laboratory，Guangxi Academy of Sicence，Nanning 530007，China）
ZHENG Juan-mei，WEI Wen-jun，LEI Xin-chao
（Guangxi College of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）
WEI Liu-hua，SHEN Liang
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）

OBJECTIVE：To investigate the infrared spectra characteristics and the difference ofZanthoxylum nitidumin the Karst region of Guangxi，and to analyze the difference of alkaloid inZ.nitidumin the Karst region of Guangxi by HPLC.METHODS：Z.nitidumin the Karst region of Guangxi was collected to prepare FTIR spectra.Principal component analysis（PCA）was used to study the difference of spectra.The content of nitidine chloride was determined by HPLC.RESULTS：The differences of chemical compositions ofZ.nitidumin the Karst region due to the diversity of geography，latitude，climate，annual rainfall and soil.CONCLUSION：FTIR can be used to identify the differences of chemical compositions ofZ.nitidumin the Karst region rapidly，and can reflect the general information of medicinal materials accurately.

Zanthoxylum nitidum；FTIR；HPLC；Karst region；Nitidine chloride

R284.1；R927

A

1001-0408（2011）19-1785-04

Δ广西科学研究与技术开发计划项目资助课题（桂科攻0992003A-20）。

＊硕士研究生。研究方向：药物新制剂、新剂型的研制与开发。E-mail：jancemm@gmail.com

#通讯作者：副研究员。研究方向：生物物理。电话：0771-2503990。E-mail：hshushi@gxas.cn

2010-06-02

2010-09-06）