侧柏挥发性次生代谢产物的提取及 GC-MS分析

刘志明,王海英,王 芳,田 补,潘晓星

(东北林业大学 a.材料科学与工程学院生物质材料科学与技术教育部重点实验室;b.林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

“Metabolomics”在科学文献上出现于 20世纪70年代,来源于代谢轮廓分析 (metabolic profiling),由 Devaux等提出[1-3];1997年,Oliver提到了“metabolomics”[3,4],“metabolomics”是“metabolites”和“genomics”杂交而成,2000年德国马普所的 Fiehn(现在美国加州大学 Davis分校)等[5]提到了“metabolomics”,2001年“metabolomics”出现在科学出版题目上[1]。现在将“metabolomics”定位为一个静态的过程,也可称“代谢物组学”,是对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析;是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析,从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学[6]。“metabolomics”的研究分为代谢靶标分析、代谢轮廓分析、代谢指纹分析和代谢组学分析 4个层次[7]。1999年英国帝国理工大学Nicholson教授提出“metabonomics”,定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定[6,8]。“metabolomics”和“metabonomics”是当前代谢组学的两大主流领域,“metabolomics”一般以细胞做研究对象 ,“metabonomics”更注重动物的体液和组织[3]。代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物[9]。代谢组学 (metabonomics/metabolomics)是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科,是继基因组学和蛋白质组学之后的又一分支,是后基因时代的热门新兴学科,研究范围是天然产物化学传统研究上的扩展,寻找动物和人类等疾病状态的代谢标记物 (metabolic markers)[1,9-12]。代谢组学研究一般包括样品前处理、数据采集、数据分析、代谢物鉴定和代谢途径分析等。代谢组学数据的采集、处理和解析方面存在两种截然不同的学术流派,一种是采用化学计量学方法 (化学计量学是一门通过统计学或数学方法将对化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系的学科),主要应用现代分析仪器分析手段,定性定量研究生物体体液中的内源性代谢产物即代谢组,结合模式识别等化学信息学技术,分析生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差异,获得相应的生物标志物群,从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态。另一种被称为定量代谢组学或定向轮廓分析,尽可能多地识别和定量样品中的代谢物,再通过多元统计分析找出最重要的生物学标志或代谢途径[7,13]。吴昊[14]进行了基于气相色谱 -质谱联用技术的代谢组学研究方法在肝癌及消化道肿瘤诊断中的应用研究。

植物代谢组学主要是通过研究植物细胞中的代谢组在基因变异或环境因素变化后的相应变化,研究基因型和表型的关系以及揭示一些沉默基因的功能,进一步了解植物代谢的途径,最具有代表性的是Fiehn研究组的工作[1,3,5,9,15]。植物代谢组学技术不仅能对单个代谢物进行全面的分析,而且能帮助人们更好地了解生物体中的代谢途径、生物体中各种复杂的相互作用及生物系统对环境和基因变化的响应,最终着眼于将植物代谢组学和其他组学技术整合起来,阐述植物从基因到表型的整套复杂系统是如何运行的[9]。郭娜等[16]进行了基于超高效液相 -飞行时间质谱技术的中药女贞子代谢组学研究。2002年 4月和 2003年 4月分别在荷兰和德国举行了第 1届、第 2届植物代谢组学国际会议,2004年 6月第 3届植物代谢组学国际会议在美国举行,2006年 4月第 4届植物代谢组学国际会议在英国举行,2008年 6月第 5届植物代谢组学国际会议在日本举行。我国军事医学科学院、中国科学院植物研究所和中国科学院大连化学物理研究所等单位正在进行植物代谢组学研究[1,3]。代谢组分析是代谢组学在植物中的应用之一,研究植物不同时期或者不同部位代谢物种类与含量变化,并进一步通过这些变化来推测相应的代谢途径和代谢网络[9]。侧柏〔Platycladus orientalis(Linn.)Franco.〕为柏科(Cupressaceae)侧柏属中国特有树种,产于内蒙古南部、吉林、辽宁、云南、湖北等省区,河北兴隆、山西太行山区、陕西秦岭以北渭河流域、云南澜沧江流域山谷中有天然森林。木材淡黄褐色,富树脂,耐腐力强。常栽培做庭园树[17,18]。种仁,称柏子仁,有养心安神、止汗、润肠功效。枝梢和叶片称侧柏叶,有凉血止血,生发乌发、防脱发等功效[19,20]。水蒸气蒸馏(hydrodistillation)是药典中常用的提取中药挥发性化合物或植物精油的传统方法之一,植物精油是由植物次生代谢产生的代谢产物,这种蒸馏方法可以让植物细胞的细胞壁破裂,以蒸气的状态释出细胞中所储藏的挥发性次生代谢产物[21,22]。刘欣等[23]进行了高山被孢霉挥发性次生代谢产物分析,陈友地等[24]研究结果表明江苏徐州林场侧柏木材精油品质优于叶、果壳和树皮精油,木材精油主要挥发性成分为罗汉柏烯 (45%)和柏木醇 (21.3%)。黄洛华等[25]研究了侧柏枝叶精油的化学组成与抗蚁性。本研究通过水蒸气蒸馏以蒸气的状态释出侧柏心材和边材细胞中沉积的挥发性次生代谢产物,基于气相色谱 -质谱联用技术分析侧柏不同生长时期心材和边材挥发性次生代谢产物种类与含量变化,为侧柏代谢产物分析提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

侧柏 (Platycladus orientalis)试材 2004年 8月中旬采自湖北省竹山县九华林场,年轮为 20年。按从根到梢的顺序平均锯为 3段 (每段长约 1.1 m)于 8月末运到东北林业大学实验室,自然气干 2个月后,将中部树干按从根到梢的顺序再次锯成 5～7 cm厚的圆盘,贮存于冰柜中备用。试验取中部树干圆盘(近根端)作为本次实验原料,将该圆盘的心材以年轮 (每 6年轮)均匀分为 3组,按从髓心心材到外缘心材的顺序分别标记为:A(髓心近处心材)、B(中部心材)、C(外缘心材),加上 D(边材 )共计 4种试验原料,将每一部分用粉碎机将其粉碎后制备成通过 2 mm筛子的木粉,盛于磨口塞玻璃瓶并置于冰柜中备用。

1.2 方法

1.2.1 侧柏挥发性次生代谢产物的提取 4种试验原料分别水蒸气蒸馏 (hydrodistillation)提取[26,27],获得的提取液分别用乙醚萃取,加入适量无水 Na2SO4干燥 15 min,过滤后置于 40℃水浴下蒸干乙醚溶剂,得到浅黄色油状侧柏挥发性次生代谢产物。A-D侧柏挥发性次生代谢产物得率分别为 0.15%、1.11%、2.02%和 0.23%。

1.2.2 侧柏挥发性次生代谢产物的气相色谱 -质谱分析 用正己烷 (色谱纯)分别将侧柏挥发性次生代谢产物配制成质量浓度为 0.04 g·mL-1的正己烷溶液,利用 GC-MS 6890N-5973insert气相色谱 -质谱联用仪 (美国 Agilent公司生产)分别对侧柏挥发性次生代谢产物进行 GC-MS分析。色谱分析条件如下:色谱柱为 DB-17MS毛细管柱(30 m×0.25 mm ×0.25μm);检测器为 FI D检测器;初始温度 80℃(保持 4 min),以 10℃min-1的升温速度升到 135℃(保持 5 min),再以 5℃min-1的升温速度升到 235℃(保持 2 min)。进样口温度270 ℃,进样量 1.0μL,分流比 10∶1,氦气载气,流速 1 mL min-1。质谱分析条件:EI离子源,接口温度 280℃,离子源温度 230℃,轰击电压 70 eV,相对分子质量扫描范围:15～500 u。

2 结果与讨论

侧柏挥发性次生代谢产物气相色谱 -质谱 (GC-MS)的总离子流色谱图如图1(横轴 -时间 /min,纵轴 -丰度,从左到右依次为 A-D)所示。

经计算机质谱库自动检索、解析和部分化合物的人工解析,通过面积归一化法计算各化合物的质量分数,侧柏主要挥发性次生代谢产物列于表1。

表1 侧柏主要挥发性次生代谢产物

从图1和表1可以看出,侧柏挥发性次生代谢产物 (A)21种成分中 12种主要挥发性次生代谢产物被鉴定,主要挥发性次生代谢产物为柏木醇(40.14%)、罗 汉 柏 烯 (12.96%)、花 侧 柏 烯(10.45%)、马兜铃烯 (4.71%)、α -杜松醇(3.55%)、柏木烯 (1.49%)、雪松烯 (1.13%)和 α-柏木烯 (0.82%)。侧柏挥发性次生代谢产物(B)20种成分中 9种主要挥发性次生代谢产物被鉴定,主要挥发性次生代谢产物为柏木醇 (41.13%)、愈创木烯 (12.12%)、罗汉柏烯 (7.48%)、雪松烯(3.87%)、花侧柏烯 (3.47%)和 α -柏木烯(0.89%)。侧柏挥发性次生代谢产物 (C)18种成分中 7种主要挥发性次生代谢产物被鉴定,主要挥发性次生代谢产物为 8-丙氧基 -香松烷(49.71%)、罗汉柏烯 (11.15%)、雪松烯 (3.52%)、α-杜松醇 (2.18%)和花侧柏烯 (2.10%)。侧柏挥发性次生代谢产物 (D)17种成分中 9种主要挥发性次生代谢产物被鉴定,主要挥发性次生代谢产物为 8-丙氧基 -香松烷 (44.03%)、罗汉柏烯(13.38%)、雪松烯 (4.09%)、花侧柏烯 (3.63%)和α-杜松醇 (2.83%)。

侧柏挥发性次生代谢产物 (A-D)共有挥发性次生代谢产物为罗汉柏烯、雪松烯和花侧柏烯。

年轮低于 6年和 6～12年侧柏心材质量分数最高的挥发性次生代谢产物均为柏木醇 (40.14%,41.13%),蒋继宏等[28]研究结果表明柏木醇对人肺癌细胞 NC1-H460半致死浓度为 44.98μg·mL-1。年轮低于 6年、6～12年、12～20年侧柏心材和边材挥发性次生代谢产物中只有 6～12年侧柏心材挥发性次生代谢产物中含有愈创木烯,且不含有α-杜松醇。侧柏的代谢途径及代谢机制有待进一步研究。

图1 侧柏挥发性次生代谢产物的总离子流色谱图(A-D)

3 结 论

(1)水蒸气蒸馏 (hydrodistillation)提取结果表明年轮 12～20年侧柏心材挥发性次生代谢产物得率 (2.02%)最高。

(2)基于气相色谱 -质谱联用技术对侧柏挥发性次生代谢产物进行了分析,研究结果表明年轮低于 6年和 6～12年侧柏心材质量分数最高的挥发性次生代谢产物均为柏木醇 (40.14%,41.13%),年轮 12～20年侧柏心材和边材质量分数最高的挥发性次生代谢产物均为 8-丙氧基 -香松烷(49.71%,44.03%)。

(3)侧柏年轮低于 6年、6～12年、12～20年心材和边材的挥发性共有次生代谢产物为罗汉柏烯、雪松烯和花侧柏烯。年轮小于 6年、6～12年、12～20年侧柏心材和边材挥发性次生代谢产物中只有 6～12年侧柏心材挥发性次生代谢产物中含有愈创木烯且不含有α-杜松醇。

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