维吾尔药材地锦草 HPLC指纹图谱的研究

谭秀芳,李晓瑾,王 强,石明辉,杨 杰,曹 园

(1.新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐 830054;2.新疆中药民族药研究所,新疆乌鲁木齐 830002;3.中国药科大学中药学院,江苏南京 210009)

地锦草为大戟科植物地锦 Euphorbia hum ifusa W illd.或斑地锦 Euphorbia m aculataL.的干燥全草,是中医、蒙医、维吾尔医常用药材,在《中华人民共和国药典》、《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药品分册》和《内蒙古药材标准》均有记载[1,2]。中医认为:地锦草具有清热解毒、凉血止血之功能,多用其治疗菌痢、肠炎、病毒性肝炎、各种出血症等疾病;地锦草维吾尔医习用名为夏塔热 (Xiahatereqini)、雅丽蔓 (Yalman-kulake),维医认为:地锦草具有清除异常黏液质、胆液汁及败血、消肿止痒之功能,多用其复方治疗手癣、体癣、足癣、银屑病、过敏性皮炎等疾病,维医临床应用地锦草与中医有很大差异,具有特色之处。地锦草分布于全国各地,资源极其丰富。而目前,有报道其化学成分主要有黄酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣质及酚酸类等化合物[3],对地锦草的研究还很缺乏,质量评价方面仅建立了地锦草中芦丁、槲皮素、木犀草素和山柰酚 4种有效成分的含量测定方法,对其指纹图谱研究未见报道。因此,本文通过对新疆和田 10个地区的地锦草 HLPC指纹研究和分析,建立了地锦草的 HPLC指纹图谱,为控制维吾尔药材地锦草质量提供参考。

1 仪器与材料

Agilent1100高效液相色谱仪,H66MC型超声清洗振荡器,Sartorius BS110S万分之一分析天平。甲醇为色谱纯 (汉邦),水为市售纯净水。地锦草药材(10批)主要来自新疆和田墨玉县 (见表1)。经新疆中药民族药研究所李晓瑾研究员鉴定为地锦草。

表1 样品采集地及采集时间

2 方法与结果

2.1 以芦丁峰为参照峰建立指纹图谱

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Shim-pack ODS C18(150 mm ×4.6 mm.i.d.,5.0μm);流动相:

A液:0.1%磷酸,B液:甲醇,按表2梯度洗脱,检测波长为 272 nm,柱温为 30℃,进样量:5μL。检测时间为 60min。

表2 梯度洗脱程序

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量,加甲醇制成溶液,即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 将地锦草药材粉碎(过 40目筛 ),取 500 mg精密称定,加入 20 mL甲醇,超声处理 30 min,过滤,用少量甲醇洗涤残渣,合并至滤液中,回收至干,加适量水混悬,用正丁醇萃取三次,每次 20 mL,合并萃取液,减压回收至干,残渣用甲醇转移并定容至 10 mL,精密吸取 1 mL,定容至 10 mL,过 0.45μm的微孔滤膜,即得。

2.1.4 测定方法 各供试品溶液进样 5μL,在上述色谱条件下进行分离测定,记录色谱图。以芦丁特征峰为参照峰,计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 精密度试验

取同一产地供试品 (S1)溶液 5μL,连续进样 5次,测定指纹图谱,结果表明,共有峰的相对保留时间的 RSD均小于 0.4%,表明仪器精密度良好。

2.1.5.2 稳定性试验

取供试品 (S1)溶液 5μL,分别在 0、2、4、8、24、48 h进样 5次,结果表明,共有峰的相对保留时间的RSD均小于 1.2%,表明供试品溶液在 48 h内稳定。

2.1.5.3 重现性试验

取同一产地样品 (S1)粉末 5份,制备供试品溶液,测定指纹图谱,结果表明共有峰相对保留时间的RSD均小于 0.7%,表明本法测定的重现性良好。

2.1.6 HPLC指纹图谱的建立

取供试品溶液 5μL,注入液相色谱仪,按选定的测试条件进行检测。同一条件下,测定所有供试品的 HPLC色谱图 (见图1)。根据 10批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值 (积分值)和峰位 (相对保留时间)等相关参数,进行分析、比较,制定优化的指纹图谱。

图1 10批药材标准 HPLC图谱

2.1.7 指纹图谱分析

按 2.1.4项测定 10批地锦草样品和对照品,其色谱图见图1,检测结果见表3、4。根据 10批供试样品 HPLC图给出的相关参数,比较、分析供试品谱图和对照品谱图,采用相对保留时间标定共有指纹峰,标定了 13个峰为共有指纹峰,建立了地锦草药材的 HPLC图谱。共有指纹峰的峰号 (相对保留时间):1(0.210),2(0.329),3(0.434),4(0.446),5(0.534),6(0.622),7(0.637),8(0.652),9(0.707),10(S)(1),11(1.062),12(1.104),13(1.133)。

表3 地锦草药材共有峰相对保留时间

表4 地锦草药材共有峰峰面积比值

地锦草相似度评价:将 10个批次地锦草样品HPLC测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统 (2004A)”软件,经校正,将谱峰自动匹配,然后生成对照图谱,进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出地锦草样品 HPLC指纹图谱共有模式图,见图2,与共有模式比较,10个批次地锦草相似度见表5。

图2 10批地锦草 HPLC指纹图谱共有模式图

图3 地锦草药材的全波长扫描图

表5 10批地锦草药材相似度

3 讨 论

3.1 提取方法的考察

考察不同浓度甲醇 (0%,30%,60%,90%,100%)及乙醇 (0%,30%,60%,90%,100%)的提取效率,以 100%甲醇的提取液中色谱峰的数目及总峰面积最大,因此选择甲醇为提取溶剂。考察甲醇冷浸、超声 30 min及加热回流 1 h的总峰面积,以甲醇超声 30 min及加热回流 1 h总峰面积最大,由于超声法省时,所以选择甲醇超声 30 min。

以甲醇提取液直接进样发现,基线漂移严重,杂质峰多,干扰严重。将提取液回收至干,水混悬,正丁醇萃取后,杂质去除干净,大多数色谱峰达到基线分离。因此,将样品用甲醇提取后,用正丁醇萃取,去除杂质,富集所需成分。为保证萃取完全,进一步对萃取次数进行考察,分别用等量正丁醇萃取 1次,2次,3次,4次,5次,发现萃取至 3次时总峰面积不再增加,证明用等量正丁醇萃取 3次能保证成分充分提取。

3.2 流动相的选择

考察了甲醇 -水、乙腈 -水、甲醇 -乙腈 -水系统,以甲醇 -水系统色谱峰分离度最佳,因此,选择甲醇 -水系统为流动相。另外,此时色谱峰拖尾严重。考察了甲醇 -0.5%甲酸水、甲醇 -0.5%乙酸水、甲醇 -0.1%磷酸水系统,以甲醇 -0.1%磷酸水系统所得色谱峰峰形最佳,因此,最终采用甲醇-0.1%磷酸水系统为流动相。

3.3 检测波长的选择

经 DAD检测器在 190～400 nm扫描,在 272 nm左右给出的色谱峰信息较多,且各个色谱峰响应值相当,所以选择 272 nm处检测 (见图3)。

根据实验结果可知研究采用了 HPLC技术,建立了地锦草的指纹谱。在实验色谱条件下,能得到较多的色谱峰且分离效果好,椐此所得的相对保留值也十分稳定,所建立的色谱指纹谱具有较大的稳定性和可控性。我们认为该方法能得到地锦草药材所含组分的大量信息,其指纹谱能反映地锦草药材的内在品质。可用于地锦草药材品质和真伪品的鉴别。

[1] 额尔登高娃,贺喜格达来.地锦草蒙医应用与研究[J].中国民族医药杂志,2008,1(1):29.

[2] 李治建,古力娜·达吾提,斯拉甫·艾白.维药地锦草的研究进展[J].中国民族医药杂志,2008,8(8):15

[3] 柳润辉,孔令义.地锦草脂溶性成分研究[J].天然产物研究与开发,2005,17(4):437.