基于RAPD技术探讨黄精属部分药用植物系统位置

朱 艳，孙 伟，秦民坚*，张朝凤*

［1.中国药科大学中药学院，江苏南京211198;2.无限极(中国)有限公司，广东广州510665］

黄精属Polygonatum隶属于百合科Liliaceae，由Miller 1754年建立，迄今已发表60余种，广布于北温带，主要分布于喜马拉雅到日本一带，中国约39种，其中20种为我国特有种。《中华人民共和国药典》(2010年版一部)收载本属中药材黄精(滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.，黄 精 P.sibiricum Red.，多花黄精 P.cyrtonema Hua.)和玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce［1］，而民间药用来源较为复杂，有近十几种。1875年Baker［2］根据叶序将黄精属分为互生叶类Alternifolia、轮生叶类Verticillata和对生叶类Oppositifolia，由于各类群间性状交叉，地理分布区重叠，该属的分类一直存在争议［3］，随着新类群和变异型不断发现［4］，该属至今没有统一的分类系统，导致同属常用中药材黄精和玉竹的原植物鉴定困难和应用混乱。

随着分子生物技术的发展，从分子水平来探索黄精属系统问题已经成为可能，如:Tamura等［5］对黄精属17种及1变种的trnk基因进行PCR、RFLP分析，支持将黄精属分成两组的观点;吴世安等［6］对黄精属植物trnk基因和rpl16基因进行进行PCR、RFLP分析，认为互生叶种类组成了一单系，而轮生叶和对生叶种类为多系关系，不构成一个单系;近年来，多篇文献报道［7－9］利用 RAPD技术鉴定玉竹类药材，周晔等［10］对黄精属部分药用植物亲缘关系进行探讨，发现不同产地的玉竹、小玉竹和多花黄精出现一定的变异。本文在前人研究的基础上，通过RAPD技术对黄精属部分药用植物的亲缘关系进行分析，首次报道了狭叶黄精，长梗黄精、湖北黄精在此系统树中的位置，利用RAPD技术对黄精属药用植物进行DNA指纹图谱研究，以期从遗传学角度为黄精属属内关系和种的鉴别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

共20批样品，黄精属药用植物19批(6种)，原植物均采集人鉴定，由安徽师范大学赵丽琴老师和中国药科大学张朝凤老师协助审核，将百合科万寿竹属的宝铎草(Disporum sessile D.Don)设定为外类群进行试验结果的聚类分析，以上实验材料均于2010年7月至2011年3月间采自江苏、安徽、昆明、湖北、吉林等地，每个样品随机取样10株，于－20℃冰箱保存。具体来源见表1，凭证标本保存于中国药科大学中药资源教研室。

表1 用于RAPD分析的原植物来源

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取

参照改良 CTAB法［11］，稍加改动，具体如下:植物材料经蒸馏水洗净后用吸水纸吸干，剪碎，在研钵内用液氮冷却碾碎成细粉。取200 mg材料置于1.5 mL的离心管内，加入65℃预热的提取液1 mL，置65℃水浴，并不断震摇，提取40 min。室温，8 000 r/min离心10 min。吸取上清液至另一1.5 mL的离心管中，加入等体积的氯仿－异戊醇(24∶1)萃取液，轻轻颠倒混匀。室温，10 000 r/min离心10 min，小心吸取上清液至另一离心管中，重复上述步骤2～3次，直至两相间的蛋白质除尽。吸取上清液至另一干净的离心管中，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，－20℃放置1 h。4℃ ，12 000 r/min离心20 min。弃去上清液，沉淀用70%乙醇300 μL漂洗2次，4℃，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。室温风干，用50 μL双蒸水溶解DNA，4℃保存待用。

1.2.2 PCR 反应

PCR反应体系的总体积为25μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L－1MgCl22.5 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 2.5 μL，10 mmol·L－1引物 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，Template DNA 5 ～10 ng，ddH2O 补足至 25 μL。

扩增程序为:94℃预变性3 min，94℃变性50 s，36℃复性50 s，72℃延伸100 s，40 个循环后，72℃延伸5 min。以ddH2O代替模板DNA作空白对照。扩增产物以于1.5%琼脂糖凝胶上，用1×TAE电泳缓冲液电泳，紫外检测电泳结果并拍照。

1.3 数据统计与分析

对凝胶紫外成像系统中重复性好且清晰的条带进行统计分析，以DNA Marker DL2000作分子量标记，比较反应条带在凝胶上的迁移率，将迁移率相同的条带视为同源位点，得到［1，0］数据矩阵(有条带计为“1”，无条带计为“0”)，用 SPSS分析软件中的Jaccard方法计算黄精属药用植物及宝铎草的相似系数，用Withingroups linkage方法进行聚类分析，建立黄精属药用植物的亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 RAPD 扩增

随机选择1份样品，分别用50条10bp随机引物(上海生工生物技术有限公司合成)进行引物初筛，从50条引物中筛选出谱带清晰且多态性较好的引物进行复筛，最终筛选出7条扩增条带清晰、反应稳定且多态性较好的随机引物用于黄精属植物的RAPD分析，其中引物S51的扩增结果见图1。7条RAPD随机引物的序列及其扩增结果见表2，由表2可见，7条引物共扩增出条带48条，其中多态性条带37条，平均多态性条带百分率达77.1%，扩增产物多集中在200～2000 bp。

图1 引物S51的RAPD扩增图谱

表2 用于RAPD分析的引物序列及扩增结果

2.2 聚类分析

根据RAPD结果计算供试的黄精属药用植物及宝铎草间的相似系数，可以看出宝铎草与黄精属药用植物的相似系数非常低，其中与安徽霍山的长梗黄精相似系数最低，为0.077，与中国药科大学药用植物园的玉竹相似系数最高，也仅为0.190。黄精属药用植物与宝铎草的聚类分析结果见图2。

图2 基于RAPD分析的黄精属部分药用植物聚类图

取λ=14，供试的样品被明显分为两大类，黄精属的药用植物全部聚为一类(C类)，而宝铎草单独聚为一类，从分子水平论证了宝铎草被划归于百合科万寿竹属，而不是黄精属。这也从一定程度上说明了黄精属在“属”一级上的分类特征比较清晰，与近缘类群容易区分，是公认的比较自然的属。取λ=7.5处，黄精属药用植物被分为4类，聚类图上出现交叉现象，来自湖北赤壁的湖北黄精，安徽六安霍山的长梗黄精没有与其它的黄精属药用植物聚在一起，而是各自单独作为一类，说明这两种植物与黄精属的其它药用植物之间的亲缘关系较远。不同产地的玉竹基本上聚在一起，λ=5.5处，玉竹与来自南京、安徽的多花黄精聚在一起(B类)，但是来自浙江天目山的多花黄精却聚到了不同产地的黄精这一支(A类);来自昆明的4种黄精与陕西黄精聚在一起，而来自广西桂林、云南富民、南京中山植物园的黄精与吉林的狭叶黄精却聚在一起，从中可以看出部分种类在地理分布上相互重叠，种的界限相对比较模糊。

3 讨论

黄精属药用植物的分类一直是个难题，特别是近年来新种的发表［12］，更增添了分类与鉴定的困难，这从黄精属部分药用植物的聚类图上可窥见一斑。从我们收集的黄精属药用植物的形态外观来看，来自陕西渭南的黄精与来自吉林长白山的狭叶黄精均为轮生叶，在λ=5处并未聚为一类，而在λ=7.5处与其它来自不同产地的黄精聚为A类，这可能从一定程度上说明了互生叶系与轮生叶系的某些植物中的某些形态上已存在差异减小的现象，这也印证了吴世安［6］认为黄精属仍处在比较活跃的分化期的观点。

湖北黄精根茎味苦，不能入药，长梗黄精一直以来被视为黄精的掺伪品，误食不但不能达到临床疗效，甚至引发中毒，两者各自单独聚为1类，从而很好地与黄精属其它药用植物区别开来。

RAPD分析用于分类和鉴定，有其独到的优势，可在不知道目的基因序列的情况下产生丰富的DNA多态性［13－14］，因此被成功地运用于动植物药材品种鉴定、原植物的种属特异性研究、易混淆品种的鉴别许多方面。长梗黄精和湖北黄精在植物形态均为互生叶，利用RAPD技术分可明显的区分这两个非药源品种，首次确定了包括狭叶黄精在内3个非药源植物与《中国药典》记载的黄精、多花黄精以及玉竹之间的亲缘关系，认为来自云南昆明的4种黄精与陕西的黄精亲缘关系比较接近，而广西桂林、云南富民、南京中山植物园、吉林长白山的狭叶黄精亲缘关系比较接近，至于来自浙江天目山的多花黄精为何没有与产自安徽六安霍山、南京的多花黄精聚在一起，有待采用其它分子生物学方法来进行更深入的研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:288，78.

［2］Baker J D.Revision of the genera and species of Asparagaceae［J］.Linn Soc Bot，1875，14:508－632.

［3］Jeffrey C.The genus Polygonatum(Liliaceae)in Eastern Asia［J］.Kew Bull，1980，34(3):435－471.

［4］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第十五卷［M］.北京:科学出版社，1978:52－80.

［5］Tamura M N ，Schwarzbach A E，Kruse S et al.Biosystematic studies on the genus Polygonatum(Convallariaceae)［J］.Molecular phylogenetic analysis based on restriction site mapping of the chloroplast gene trnk.Feddes Report，1997，108(3－4):159－168.

［6］吴世安，吕海亮，杨 继，等.叶绿体DNA片段的RFLP分析在黄精族系统学研究中的应用［J］.植物分类学报，2000，38(2):97－110.

［7］刘塔斯，李 钟，刘春林.玉竹及其混淆产品黄精的RAPD分析［J］.中国药学杂志，2002，37(10):734－736.

［8］王润玲，唐 铖，周 晔，等.玉竹及其掺伪品的 RAPD鉴定［J］.中草药，2006，37(11):1727－1729.

［9］李新娥.用RAPD技术鉴别湖南道地药材玉竹［J］.中医药导报，2010，16(9):97－98.

［10］周 晔，唐 铖，张 攻等.随机扩增多态性DMA技术与简单序列重复标记法探讨部分黄精属药用植物亲缘关系的研究［J］.时珍国医国药，2008，19(7):1646－1647.

［11］Clark M S.植物分子生物学－实验手册［M］.顾红雅，礼 嘉主译.北京:高等教育出版社，1998:3－7.

［12］吴珍兰，杨永昌.青海黄精属一新种［J］.西北植物学报，2005(10):2088－2089.

［13］Williams J G K，Kubelik A R，Kenneth J L，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(22):6531－6535.

［14］Welsh J，Moclewomd M.Fingerp rinting genome using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18:7213－7218.