均匀设计实验法优选朝鲜淫羊藿微波提取工艺的研究

姚慧敏，丁健秋

(通化师范学院 制药与食品科学系，吉林 通化 134002)

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、箭叶淫羊藿(EpimediumSagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)、巫山淫羊藿(Epimediumwushanense)和朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)干燥叶，又名仙灵脾，在《神农本草经》中列为中品．《本草纲目》中称其有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”等功效[1]．淫羊藿味辛甘、性温，归肝、肾经，用于治疗阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛和更年期高血压等疾病[2]．研究表明淫羊藿苷(Icariin)是其主要活性成分，它是一种8—异黄酮苷类化合物，具有增加心、脑血流量，雄激素样作用，促进骨代谢和免疫功能[3-4]，降血糖，抗衰老和抗肿瘤等功效[5]．本文研究建立了测定淫羊藿中淫羊藿苷含量的高效液相色谱法，通过均匀设计方法优化了淫羊藿的微波提取工艺，确定了淫羊藿苷的最佳提取条件，为淫羊藿药材的进一步开发和利用奠定基础．

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪(四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站)，XH—200A电脑微波固液相合成/萃取仪(北京祥郜科技发展有限公司)，超声波清洗器(必能信超声有限公司)，朝鲜淫羊藿(采自吉林省集安市，经过通化师范学院于俊林教授鉴定)，淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0737—9910，供含量测定用)．甲醇、乙腈均为色谱级，其他试剂均为分析纯，水为纯净水．

2 方法与结果

2.1 淫羊藿苷含量测定方法的建立

(1)色谱条件.色谱柱：Agilent Ecilpse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm).流动相：水-乙腈(74：26)；流速为1.0mL/min.检测波长：270nm.柱温：30℃．在此条件下，理论板数按淫羊藿苷计应不低于2000．

(2)溶液的配制.供试品溶液的制备：取淫羊藿浸膏50mg，精密称定，置25mL容量瓶中，用无水乙醇至刻度，超声处理30min后，滤过，精密吸取续滤液1.0mL，置10mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，即得．

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加无水乙醇定量制成每1mL中分别含248μg的溶液，作为对照品贮备液．

(3)系统适用性.取供试品溶液，进样，依法测定，记录色谱图，淫羊藿苷理论塔板数分别为3，7，0，4，系统适用性试验符合要求．

(4)标准曲线的绘制.分别精密吸取贮备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL至10mL量瓶中，用无水乙醇至刻度，分别制成系列浓度溶液，摇匀，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，淫羊藿苷在4.96～49.6μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，其线性回归方程为：C=0.0283A+0.2766(r=0.9999)．

(5)进样精密度试验.取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷浓度均为24.5μg/min的供试品溶液，日内和日间反复注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积，日间RSD为0.43%，日内RSD为0.27%，结果表明本品的日内、日间精密度良好．

(6)稳定性试验.取淫羊藿苷浓度24.5μg/min的供试品溶液，分别于0，1，3，6，12h，注入液相色谱仪，记录色谱图的峰面积，RSD为0.32%，结果表明溶液放置12h稳定．

(7)重复性试验.取淫羊藿提取物，按供试品溶液制备方法制备并测定，记录色谱图的峰面积，按标准曲线计算样品含量，RSD为0.58%．

(8)回收率试验.精密称取已知含量的淫羊藿提取物50mg(含淫羊藿苷120.5mg/g)，共6份，精密加入等量的淫羊藿苷对照品，按含量测定项下稀释，分别进样3次，记录色谱图，将峰面积带入线性回归方程，计算测定结果，淫羊藿苷的平均加样回收率为99.7%，RSD=0.38%．

(9)样品测定.取淫羊藿浸膏50mg，精密称定，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，取供试品溶液和对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量．三批供试品含量测定结果见表1．

表1 朝鲜淫羊藿浸膏中淫羊藿苷含量测定结果表

2.2 淫羊藿提取方法及优化

(1)单因素考察.为了考察微波功率、提取时间、固液比、乙醇浓度等因素对超声波提取淫羊藿苷的影响，进行了单因素的试验考察，结果发现影响淫羊藿苷提取率的主要因素为超声功率、提取时间和溶剂倍数．经过预试验确定提取溶剂为80%乙醇，3个主要因素的取值范围：超声功率为350～600W，超声提取时间为10～35min，溶剂倍数为5～10倍．

(2)均匀设计优选表.将超声功率、提取时间和溶剂倍数确定为3个因素，每个因素等分为6个水平，按照确定的因素和水平数，选择均匀设计表中U6﹡(64)使用表的1、2、3列．具体试验方案和结果见表2．

(3)均匀设计结果.使用Version2.2数据处理系统软件进行逐步回归处理，得到回归方程Y=1.269+0.00947X1+0.00426X2+0.000518X3，其中Y为淫羊藿苷含量、X1为超声提取时间、X2为固液比、X3为乙醇浓度．方差分析结果详见表3，由表3可知，复相关系数R=0.9935，F=90.35，表明该回归方程在α=0.05水平上有显著意义．由于各自变量的变化范围不同，因而不能直接用偏回归系数数值的大小来说明各变量的重要性，为此要运用标准化偏回归系数(standardpartialregressioncoefficient)．将回归方程偏回归系数进行标准化处理得标准化偏回归系数(Bi)，B1=0.8917，B2=0.8503，B3=0.0561．分析标准化偏回归系数及方程可知，影响超声提取的因素依次为超声功率、提取时间和溶剂倍数．对数据处理软件获得的回归方程进行自动实验优化程序处理，并结合实际经验，选择淫羊藿苷的最佳超声提取条件为：超声功率400W，提取时间为20min，溶剂倍数为8倍．

表2 均匀实验设计方案和结果表(n=3)

表3 方差分析结果表

(4)优选工艺条件的验证实验.根据优化工艺进行淫羊藿苷的提取，精密称取淫羊藿100.0g，制备3批样品，按“2.1中(9)”项下方法测定，测得淫羊藿苷的转移率为94%，RSD为0.38%，表明优选工艺提取朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷转移率高，重现性好．

3 讨论

(1)本实验确定3个因素，每一因素设计了6个水平，共6次试验进行研究，完成了淫羊藿中淫羊藿苷的提取工艺优化．若采用正交设计，则至少要做63=216次试验．为减少试验次数，故本实验采用了均匀设计法．均匀设计是我国数学家方开泰创立的一种多因素试验设计方法，由于抛开了正交设计中的“整齐可比性”而只考虑试验点的“均匀分散性”，那些在正交设计中为整齐可比而设置的试验点可以不再考虑，因而用均匀设计安排试验可大大减少试验次数[6，7].

(2)淫羊藿的主要有效成分为苷类，此类成分易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂[8]，故常采用水、乙醇等溶剂进行提取．以水为溶媒进行提取时，浓缩时间过长，有效成分破坏大，以乙醇为溶媒提取时，杂质成分多，尤其是含叶绿素多，所以本实验选用水—乙醇混合溶媒为提取淫羊藿苷的溶剂．

(3)分别考察了甲醇—水等各种比例作为流动相洗脱，结果发现淫羊藿苷峰型差．因此，采用不同比例的乙腈—水作为流动相洗脱，当乙腈—水的比例为26:74时，淫羊藿苷的出峰时间适中，基线平稳，峰形较好且与其他组分能够完全分离．

(4)通过考察微波功率、提取时间和溶剂倍数3个因素对淫羊藿苷提取转移率的影响，经均匀设计优化分析后，确定了淫羊藿超声提取最佳工艺：超声功率400W，提取时间为20min，溶剂倍数为8倍，根据优化工艺进行淫羊藿苷的提取，淫羊藿苷的转移率为94%，表明优选工艺提取朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷转移率高，重现性好．

参考文献：

[1]李作洲，徐艳琴，王瑛，等.淫羊藿属药用植物的研究现状与展望[J]．中草药，2005，36(2)：289.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[M].北京：化学工业出版社，2005.

[3]Nian H，Xu LL，MA MH，et al.Prevention of bone loss by aqueous extract of Epimedii sagittatum in an ovariectomized rat model of osteoporosis[J].J Chin Integr Med，2006，4(6):628.

[4]Kovacevic N，Colic M，Backovic A，et al.Immunomodulatory effects of the methanolic extract of Epimedium alpinum in vitro[J].Fitoterapia，2006，77(7-8):561.

[5]陈燕芬，冯怡，洪宋贞，等.微波技术提取中药淫羊藿的研究[J]．中国中药杂志，2005，30(20)：1625.

[6]夏新华，吴卫，何莉，等.均匀设计法优选红花提取工艺[J]．中药材，2006，29(11)：1251.

[7]杨帆，钟桂雄，赵洪普，等.不同方法提取淫羊藿苷的正交试验研究[J]．中国药房，2005，16(6)：416.

[8]欧少英，杨帆.利用正交试验法优化淫羊藿有效成分的超声波提取工艺[J]．中药材，2004，27(6)：442.