高效液相色谱法测定食品中的富马酸二甲酯

郑晓冰 赵质创 肖晓槟

(汕头市质量计量监督检测所，汕头 515041)

富马酸二甲酯(Dimethyl fumarate,简称DMF)，又称反丁烯二酸二甲酯，俗称霉克星，为白色片状或粉末状结晶，易升华，微溶于水，易溶于乙酸乙酯、氯仿、乙腈、丙酮和醇类，对光热较稳定。富马酸二甲酯是美国20世纪80年代开发出来的一种新型防霉剂，对许多霉菌有特殊的抑制效果，且具有抗真菌能力，广泛应用于食品、饮料、饲料、中药材、化妆品、鱼、肉、蔬菜、水果等防霉、防腐、防虫、保鲜中。但是富马酸二甲酯对皮肤产生过敏性伤害(黏膜刺激)，长期接触会发生皮肤过敏甚至溃烂，经食道吸入可能会对人体肠道、内脏产生腐蚀性损害，特别是对儿童的成长发育造成极大伤害[1]。2009年1月29日欧盟成员国通过了“保证含有富马酸二甲酯的消费品不会投放欧洲市场”的决议草案，该决议于2009年5月1日正式生效。草案明确规定，如果消费品或其部件中富马酸二甲酯的含量超过了0.1 mg/kg，或者产品本身已声明其富马酸二甲酯的含量，就将被认定为“含有富马酸二甲酯”的产品而禁止进入欧盟市场流通和销售。我国禁止在食品中添加富马酸二甲酯作为防腐保鲜剂。目前文献报道富马酸二甲酯的常用检测方法有GC/FID[2，3]、GC/MS[4，5]和HPLC[6]，其中GC/FID和GC/MS方法的检测限为25 mg/kg，大大超过了欧盟的限量，已经不能满足出口食品的检测需求。我国关于食品中富马酸二甲酯的检验标准，仅有农业行业标准NY/T 1723-2009采用HPLC方法[7]，在此标准中，前处理和流动相的配制相对较为麻烦。笔者以甲醇为提取溶剂，以甲醇-乙酸铵为流动相，实现食品中富马酸二甲酯的简便、快速、灵敏、准确检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配有二极管阵列检测器(DAD)，美国Agilent公司；

超声波水浴器：SK2200LHC型，上海科导超声仪器有限公司；

有机相滤膜(尼龙)：13 mm×0.45 μm，上海安谱科学仪器有限公司；

甲醇：色谱纯；

富马酸二甲酯：纯度不小于99.0%，250 mg，美国Sigma公司；

富马酸二甲酯储备液：称取200 mg富马酸二甲酯，用甲醇溶解后定容于100 mL的容量瓶中，配制成浓度为2 mg/mL的标准储备液，贮存于0～4℃冰箱中，使用时用甲醇稀释成标准工作溶液；

乙酸铵溶液：1.55 g/L，准确称取1.55 g乙酸铵，用适量水溶解并定容至1 000 mL。

1.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×46 mm，5 μm)；流动相为甲醇-1.55 g/L乙酸铵溶液(体积比为55∶45)；流速：1.0 mL/min；柱温40℃；进样量为10 μL。

1.3 样品前处理方法

称取2.000～5.000 g粉碎的加标面包样品于50 mL带刻度具塞比色管中，加入甲醇定容至50 mL，加塞混和后置于超声波水浴中处理15 min，经0.45 μm滤膜过滤后，进样测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

取富马酸二甲酯浓度为8 μg/mL的溶液，在200～400 nm波长范围内扫描，结果显示富马酸二甲酯在210 nm处有强吸收，故选择检测波长为210 nm。

2.2 流动相比例的选择

改变流动相比例，分别对甲醇-1.55 g/L乙酸铵溶液按不同体积比(35∶65、70∶30、55∶45)进行试验。试验结果表明，流动相为甲醇-1.55 g/L乙酸铵溶液体积比为55∶45时峰形对称，效果最好。

2.3 样品前处理方法的优化

富马酸二甲酯微溶于水，易溶于醇、醚、丙酮和氯仿，考虑到醚类与乙酸铵流动相不互溶，故分别采用甲醇、氨化甲醇、丙酮和氯仿作为提取溶剂对加标样品进行前处理，测定其回收率，结果见表1。加标回收试验显示4种溶剂均可较好地提取富马酸二甲酯，均能满足检测要求，以甲醇作为提取溶剂，各组分提取效果最好，同时在液相色谱上也有很好地分离，故实验选择甲醇为提取溶剂。

表1 4种不同提取溶剂富马酸二甲酯的回收率 %

2.4 标准曲线和线性范围

将富马酸二甲酯储备液用甲醇稀释配制成浓度为1、2、4、8、16 μg/mL的标准溶液，在1.2色谱条件下进行测定，对色谱峰面积x和对应的富马酸二甲酯浓度y进行线性回归，得线性方程为y=71 284.817x-5.937(r=0.999 87)。测定结果表明，在1～16 μg/mL的浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，符合定量要求。

2.5 回收试验与精密度试验

选取饼干、月饼、蛋糕、面包4类样品，进行3水平添加回收试验，每个添加水平取6个平行样，未加标的面包样品色谱图和对应的加标色谱图见图1和图2，回收试验结果见表2。

图1 未加标的面包样品色谱图

图2 加标的面包样品色谱图

表2 回收试验与精密度试验结果 %

由表2可知，该方法回收率为85.3%～116.4%，回收率较高，相对标准偏差(RSD)为0.54%～2.18%，精密度较好。准确度和精密度符合富马酸二甲酯的检测要求。

2.6 检出限

选取空白蛋糕样品添加富马酸二甲酯，将含量依次降低的富马酸二甲酯加入到样品中去，对每个浓度样品测定3次，记录每次测得S/N值，结果显示，当添加0.1 μg/g时，S/N=3.1，因此该方法检出限为0.1 μg/g。检出限达到了2009年1月欧盟草案关于富马酸二甲酯规定的最低添加值，符合新的检测要求。

3 结论

采用高效液相色谱法测定食品中的富马酸二甲酯，具有灵敏度、精密度和准确度较好的特点，满足欧盟草案关于富马酸二甲酯的检测要求。与富马酸二甲酯最新测定标准NY-T 1723-2009相比，本研究采用纯甲醇提取样品中的富马酸二甲酯，相比标准用氨水甲醇溶液提取，前处理需要调节pH等步骤，更为简便、快速，保证富马酸二甲酯被最高效率地提取，且在液相色谱上有很好地分离，完全符合检测要求；采用甲醇-1.55 g/L乙酸铵溶液(体积比为55∶45)作为流动相，相比NY-T 1723-2009的也更为简便，无需添加带正电荷的四丁基溴化铵，且峰形完好，峰的保留时间和重现性均良好。试验证明该方法是一种准确、方便地测定食品中富马酸二甲酯的分析方法。

[1] 陈明，梁春穗，黄伟雄.广式月饼中富马酸二甲酯残留量测定方法[J] .中国卫生检验杂志，2001,11(1):48.

[2] 刘万山，李青，杨大鹏，等.富马酸二甲酯食品中残留检测方法的研究进展[J].中国卫生工程学，2007,6(4):250-251.

[3] DB 43/T 353-2007 食品中富马酸二甲酯残留量的测定[S].

[4] 阚周密，王建阳，王戏丹.气相色谱-质谱联用法测定食品中富马酸二甲酯的含量[J].食品科学，2007,28(1):247-249.

[5] 曹华娟，冯家力，潘振球，等.食品中富马酸二甲酯残留量的GC-MS法测定[J].实用预防医学，2007,12(1):173-174.

[6] 韩惠雯，黄菲菲，赵嘉胤，等.高效液相色谱法测定食品中的富马酸二甲酯的研究[J].上海农业学报，2009,25(3):72-74.

[7] NY/T 1723-2009 食品中富马酸二甲酯的测定 高效液相色谱法[S].