超高效液相色谱法快速测定辣椒素类物质

赵春华 侯倩慧 余季金

(青岛华测检测技术有限公司，青岛 266101) (青岛普仁仪器有限公司，青岛 266046) (青岛大学，青岛 266071)

对辣椒或其提取物中辣椒素类物质的定量分析可采用铝蓝比色法、辣椒素分光光度法、高效液相色谱法、气-质联用法、液-质联用法等多种方法。经对比可知，传统方法成本低，但准确度不够理想。现代高档仪器分析法的灵敏度和准确度都较高，但仪器价格昂贵。目前普及的液相色谱因其性价比优越和方法可靠常被用于此项工作，但分析速度还有待进一步提高。

笔者采用的超高效液相色谱法有效地解决了上述问题，不但样品前处理较简单，而且实现了3种主要辣味成分在3 min内良好地分离，定性、定量准确。此法适用于辣椒及辣椒制品辣味水平的快速、准确测量评价。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：ACQUITYTMUtra Performance LC型，配二元高压泵、二极管阵列检测器，美国Waters公司;

辣椒素(C)：纯度为98%，于(20±4)℃条件下储存，国家标准物质中心;

二氢辣椒素(DHC)：纯度为98%，于(20±4)℃条件下储存，国家标准物质研究中心;

甲醇：色谱纯，美国Teda公司；

酸性氧化铝：74～150 μm(100～200目)，上海晶纯试剂有限公司;

其它试剂为分析纯。

1.2 标准溶液配制

准确称取辣椒素和二氢辣椒素标准品0.010 g(折算为纯品)，用甲醇溶解准确定容至10 mL,配制成l g/L的标准贮备液，再用甲醇逐渐稀释分别得到0、1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/L的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

将干辣椒样品用电动粉碎机粉碎,过0.391 mm筛。称取粉碎后样品1.0 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管内，加入1.0 g酸性氧化铝粉，准确加入四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)溶液10 mL，涡旋，震荡1 min,再超声提取30 min。取出冷却至室温，移取100 μL用甲醇稀释10倍(可根据样品中辣素含量确定适当的稀释倍数),混匀，过0.22 μm滤膜备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；柱温：40℃；流动相：A为水，B为乙腈,流速为0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.5 定量测定

取系列标准溶液各进样3 μL，以浓度-峰面积绘制标准曲线(或取跟样品浓度相近的标准溶液进行单点校正)，以保留时间和该点处的光谱图定性，峰面积定量。降二氢辣椒素(NDHC)与辣椒素共用同一条标准曲线。以斯科维尔指数(SHU)计,辣椒素同系物总量x按式(1)计算：

(1)

式中：V——定容体积，mL；

m——取样量，g；

ρNDHC——降二氢辣椒素质量浓度，mg/L；

ρC——辣椒素质量浓度，mg/L；

ρDHC——二氢辣椒素质量浓度，mg/L；

9 300、16 100——斯科维尔指数(SHU)换算系数。

图1、图2分别为0.01 mg/L的标准色谱图和样品色谱图。

图1 标准色谱图

图2 样品色谱图

2 结果与讨论

2.1 流动相及去甲二氢辣椒素色谱峰的确认

通过对常用洗脱溶剂甲醇、乙腈、水以及流动相pH值等条件的优化，确定了最佳洗脱条件，见1.4色谱条件。从C的主峰分出一明显的小峰(1.415 min)，且该峰与C、DHC的峰面积比为1∶3∶6，基本符合辣椒中辣椒素同系物各组分含量的比例。该处的光谱图和1.587 min(C)及2.197 min(DHC)处的光谱图完全一样。由此可断定该峰为NDHC，理论上可以用辣椒素的标准曲线定量分析降二氢辣椒素。

2.2 检测波长的确定

从图2标准的光谱图可以看出C和DHC 的紫外全波长扫描图完全一致。在230 nm和280 nm 处出现两个吸收峰，230 nm 比280 nm 的吸收值高很多且峰形平缓，作为检测波长将更灵敏。但在短波长范围内有紫外吸收的物质越多，就越容易产生干扰。在280 nm处仪器的灵敏度已经满足测试要求，故采用280 nm处进行定量。

2.3 不同提取剂提取效果的比较

分别采用乙睛、饱和乙睛、四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)、甲醇、50%的甲醇水超声提取，试验发现,四氢呋喃-甲醇(体积比1∶1)的提取效果最好。

2.4 不同净化效果的比较

考虑使用石墨化碳和酸性氧化铝净化提取物里面的色素和油脂。净化后和净化前叠加色谱图如图3所示。

图3 叠加色谱图

从图3可以看出，使用酸性氧化铝粉使得样品前面很大的杂质峰得到很大程度的净化，而目标物C和DHC并没有明显损失。使用石墨化碳似乎已经除掉很多色素，但其前面的色谱杂质峰并没有很多变化，净化效果不理想。

2.5 检出限和定量限

对逐步稀释的标准溶液进行分析，以3倍信噪比(S/N)计算检出限，10倍信噪比为定量限。辣椒素、二氢辣椒素的检出限为0.05 mg/mL，定量限为0.25 mg/mL。

2.6 标准曲线方程

以6个浓度(1.0、10.0、30.0、50.0、70.0、100.0 mg/mL)水平绘制标准曲线，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作校正曲线并进行线性回归。C的标准曲线回归方程为Y=7 690X+14 000，r=0.999 6；DHC的标准曲线回归方程为Y=7 010X+13 500,r=0.999 7。结果表明，C和DHC在1.0～100.0 mL/L浓度范围内线性良好。

2.7 回收试验

称取已知量的供试品1.0 g，共9份，每3份为一组，分别加入低、高浓度水平的标准贮备液。按1.3 进行样品前处理，分别进样并计算回收率，结果见表2。

表2 C和DHC回收试验结果

由表2可知，C和DHC的回收率分别为93.0%～100.0%、92.9%～97.4%。

2.8 精密度试验

取10.0 mg/L的标准溶液和样品制备溶液，按1.4色谱条件，分别连续进样5次，进行精密度试验。辣椒素、二氢辣椒素测定结果的相对标准偏差分别为0.8%、1.2%(n=5)。

3 结语

建立了用甲醇-四氢呋喃(体积比1∶1)混合溶液作提取溶剂，超声波法提取辣椒素，采用超高效液相色谱法测定辣椒素的方法。此方法具有简便快捷、准确度好、灵敏度高等特点。

[1] 凌关庭.天然食品添加剂[M].北京:化学工业出版社，2000：57.

[2] 吴艳阳，陈开勋，邵纪生. 辣椒素的制备工艺及分析方法[J].化学世界，2004(4): 218-221.

[3] Busch K W, Swamidoss I M, Fakayode S O, et al. Determination of the enantiomeric composition of guest molecules by chemometric analysis of the UV-visible spectra of cyclodextrin guest-host complexes[J]. J Am Chem Soc,2003,125:1 690-1 691.

[4] ISO3513; 1995(E) Chillies-Determination of Scovillie Index[S].

[5] Irena Perucka, Wies aw Oleszek. Extraction and determination of capsaicinoids in fruit of hot pepper Capsicum annuum L. by spectrophotometry and high-performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry,2000,71(2):287-291 .

[6] Barbero G F, Palma M, Barroso C G. Determination of capsaicinoids in peppers by microwave-assisted extraction-highperformance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Anal Chim Acta,2006，578(2):227-233.

[7] Santamaria R I, Reyes-Duarte M D, Barzana E, et al. Selective enzyme-mediated extraction of capsaicinoids and carotenoids from chili guajillo puya (Capsicum annuum L.) using ethanol as solvent[J]. J Agric Food Chem,2000, 48:3 063-3 067.

[8] 蔡兴东, 刘新.高效液相色谱法测定生发凝胶中辣椒素含量[J].中国医院药学杂志，2007,27(4):494-496.

[9] Scott K J. Handbook of Food Analytical Chemistry: Volume 1[M].2005:81-90.

[10] 王燕，夏延斌，夏菠，等.高效液相色谱法测定辣椒素及辣度计算[J].辣椒杂志,2006,4(1)：37-41.

[11] AOAC 995.03 Capsaicinoids in capsicums and their extractives[S].

[12] Okada Y, Okajima H, Shima Y, et al. Hydroxylradical scavenging action of capsaicin[J]. Redox Report,2002(7):153-157.