肺孢子菌感染大鼠血清同型半胱氨酸变化分析

刘克芹，尹卫东，卢致民，唐宏伟

（1．河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口075000；2．河北北方学院医学检验学院，河北 张家口075000）

肺孢子菌感染大鼠血清同型半胱氨酸变化分析

刘克芹1，尹卫东2，卢致民2，唐宏伟2

（1．河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口075000；2．河北北方学院医学检验学院，河北 张家口075000）

目的 探讨肺孢子菌肺炎 （PCP）的发病机制．方法 纯系Wistar雌性大鼠36只随机分为PCP模型组 （P组12只）、TMP－SMZ治疗组 （S组14只）及正常对照组 （N组10只）．P组及S组于大鼠后腿肌注地塞米松 （每次1mg／只，每周2次、间隔3d），诱导建立PCP动物模型．N组同法肌注生理盐水．镜检确认PCP诱导成功后，S组从第3周起每天灌胃TMP－SMZ 1次 ［250mg／（kg·d），5d为1疗程，以后每隔2周，1个疗程］，共3个疗程．观察肺泡内肺孢子菌 （PC）情况，检测血清中同型半胱氨酸 （Hcy）水平，并与对照组 （N组）比较．结果 造模成功后Hcy测定结果逐渐增高，P组在第12周的 （11．28±1．54）g／L显著高于N组的 （9．46±1．34）g／L （P ＜0．01），S组虽也有增高趋势，但第12周 （10．58±1．97）g／L与 N 组（9．46±1．34）g／L比较差异无显著性 （P ＞0．05）．P组第9周 （10．85±1．33）g／L、12周 （11．28±1．54）g／L显著高于0周 （9．38±1．66）g／L，而S组间差异无显著性 （P＞0．05）．P组与S组间，Hcy差异无显著性 （P＞0．05）．结论 PCP造模成功后，血清中Hcy显著增高，提示血清中Hcy浓度可作为PCP感染的微血管病变的辅助诊断指标．

肺孢子菌；大鼠；同型半胱氨酸

肺孢子菌 （Pneumocystis carinii，PC）感染引起肺孢子菌肺炎 （pneumocystis carinii pneumonia，PCP）是一种免疫缺陷状态下发生的疾病，疾病进展的分子机制尚处于研究阶段．同型半胱氨酸 （hemocysteine，Hcy）是一种含硫的氨基酸，在体内多数以氧化形式与蛋白质结合，并参与血液循环．同型半胱氨酸在体内的集聚作为一种多种疾病的危险因子，与微血管病变密切相关［1－2］，而Hcy在肺孢子菌PC感染引起PCP中的变化及其与疾病进展的关系研究，至今报告甚少．本实验利用大鼠动物模型动态观察PCP大鼠血清中Hcy的动态变化，旨在进一步探讨PCP的发病机制及Hcy在该疾病进展中发挥的作用．

1 材料与方法

1．1 实验动物

纯系Wistar大鼠36只，雌性，体质量220～260g，由北京中科院遗传与发育生物研究所动物中心提供．

1．2 药物和试剂

地塞米松注射液 （批号：040202，海南制药厂有限公司），复方新诺明 （TMP－SMZ） （批号：040302，张家口云峰制药厂），盐酸四环素 （批号：20030902，张家口云峰制药厂）．同型半胱氨酸测定试剂盒 （柏定生物）．

1．3 仪器设备

自动生化分析仪 （7600，日立公司），石蜡切片机 （1512型，西德莱卡公司），电视生物显微镜（XSZ－H型，重庆光学仪器有限公司），超高倍诊断系统 （ACT－2000型，上海复星公司）．

1．4 实验及分组

1．4．1 分组 36只大鼠随机分为3组：PCP模型组 （P组）12只，复方新诺明 （TMP－SMZ）治疗组（S组）14只，正常对照组 （N组）10只．P组、S组造模，造模8周后处死大鼠，在肺组织印片中发现PC，虫体数量平均每10～20个油镜视野中查到3～5个包囊，且多为8个核的成熟包囊，未见滋养体．随造模时间的延长，PC包囊逐渐增多．第12周PC检出包囊阳性率100%，证实造模成功26只．N组大鼠于后腿肌肉注射生理盐水，每次0．25mL／只，每周2次、间隔3d；P组及S组按文献［3］方法在大鼠后腿肌肉注射地塞米松，每次1mg／只，每周2次、间隔2d．N组饮用冷开水，P组及S组饮用的冷开水中加1g／L盐酸四环素．S组从第3周起每天上午TMP－SMZ灌胃250mg／（kg·d）1次，5d为1疗程，间隔2周，共3个疗程．3组大鼠置于普通大鼠笼中，分笼饲养，喂以颗粒饲料，放在清洁干燥的实验室中，温度控制在15～25℃，每日通风2次．

1．4．2 病原学观察 从第8周起，上述3组各随机处死1只大鼠，将大鼠剖杀后立即取右侧新鲜肺组织，切出断面，取肺组织切面制作印片，甲醇固定5min，Giemsa染色，在生物显微镜及超高倍显微镜下检测PC滋养体及包囊，观察是否已诱导PC感染．

1．5 血清Hcy测定

两组于造模前 （0周）及造模后3、6、9、12周断尾取血，待全血凝固后，以3 000转／min离心10 min，立即分离血清保存于－4℃冰箱，于24h内采用速率法检测血清Hcy水平．

1．6 统计学方法

2 结 果

造模成功后Hcy测定结果逐渐增高，P组在第12周显著高于N组 （P＜0．01），S组虽也有增高趋势，但第12周与N组差异无显著性 （P＞0．05）．P组的第9周、12周显著高于0周，而S组间差异无显著性 （P＞0．05）．P组与S组间，Hcy差异无显著性 （P＞0．05）．详见表1．

表1 P．C感染后大鼠血清中Hcy的动态变化 ，g／L）

表1 P．C感染后大鼠血清中Hcy的动态变化 ，g／L）

注：与正常对照组比较＊P＜0．01，△P＜0．05；P组间与0周比较，☆P＜0．01，▲P＜0．05

分组 n 造模前 3周 6周 9周 12周N 10 9．35±1．76 9．48±1．25 9．50±1．67 9．47±1．109．46±1．34 P 12 9．38±1．66 9．62±1．15 10．68±1．73 10．85±1．33△▲ 11．28±1．54＊☆S 14 9．48±1．62 9．28±1．66 9．78±1．86 9．86±0．85 10．58±1．97

3 讨 论

PCP是一种由PC引起的呼吸系统严重的机会感染性疾病，好发于免疫功能低下人群，病理表现为氵弥漫性肺间质性和肺泡性水肿．现在认为PC是一种真菌，而不是寄生原虫，仅当宿主防御机能受损时引起疾病，最常见的是血液系统恶性疾病，淋巴增生性疾病，肿瘤化疗和艾滋病等引起的细胞免疫缺乏；PC通常局限于宿主肺泡内，因此肺泡微环境是PC与宿主细胞相互作用的场所．近年来国内外研究报道［4－5］，PCP时PC虫体与宿主细胞的相互作用，使肺泡微环境，包括组织结构和生化代谢发生一系列复杂的变化，导致肺损伤，其机制尚不明确．

Hcy是蛋白质在人体正常代谢产物，各种因素导致代谢异常，引起细胞内积聚，并进入血液循环，导致血中Hcy含量增高，形成高同型半胱氨酸血症 （hyperhomocysteinemia，Hhcy）．近年来研究发现Hhcy血症促进冠状动脉粥样硬化的进程，是冠心病的一个独立危险因素［6］．目前认为Hhcy血症可通过产生过多的氧自由基、促使血管平滑肌细胞明显增生、使血小板存活时间缩短导致血栓易于发生、增加凝血因子V和X的活性等诸多机制促进血管内皮的损伤，进而促进多种疾病的进展．而白宏林等在大鼠糖尿病动物模型中观察到［7］，随着Hcy水平增加，肾脏损害程度加重；随着病程的延长及Hcy水平的升高，肾小球基底膜及视网膜毛细血管壁厚度增厚．同时成模12周时，肾小球系膜基质增多，肾小球基底膜增厚；视网膜毛细血管扩张，基底膜增厚，周细胞消失．22周时出现肾小球弥漫性纤维化；视网膜可见新生毛细血管形成，微小动脉纤维化．电镜下，成模后12周时肾小球内皮细胞线粒体减少、水肿，嵴变短、消失，基底膜断裂；视网膜内神经细胞突起水肿，血管内皮细胞线粒体减少、峭变短或消失；22周时肾小球基底膜增厚明显，部分断裂，内皮细胞间裂增宽，细胞膜不完整，线粒体消失；视网膜内皮细胞也发生类似改变，神经细胞核固缩，胞质密度增高，粗面内质网扩大，核糖体解聚．说明Hcy水平增高导致糖尿病微血管病变的进展．

本实验观察到随疾病的进展，动物血清中的Hcy明显增加，同时组织切片也观察到间质血管增生，内皮细胞肿胀，浆细胞、淋巴细胞弥漫浸润，早期炎性渗出明显，肺泡腔及肺泡间质内出现均质淡染的浆液成分，晚期渗出吸收减少，同时出现血管周的纤维化．说明间质肺炎与微血管通透性改变明显关联，与Hcy的动态升高有关．同时还发现经过复方新诺明 （SMZ）治疗后，由于PC虫体的不断破坏，数量减少，机体免疫反应减轻，微血管仅见内皮的修复，因此未见Hcy的明显升高，同时也说明SMZ治疗PCP有效．

PCP的发病机制可能十分复杂，而本实验肺孢子菌肺炎的发病机制研究认为高Hcy导致的微血管的病变可能在疾病发展中发挥重要作用，详细机制有待进一步研究．

［1］ 李玲，代丽红．血中叶酸、维生素B12水平与高同型半胱胺酸血症的关系 ［J］．承德医学院学报2007，24（3）：269－270

［2］ 陈健，张金枝，程龙献．高同型半胧氨酸血症：心脑血管疾病的独立危险因子 ［J］．心血管康复医学杂志，2000，9（2）：89－91

［3］ 佟小莺，吴增强，张玉润．肺孢子菌肺炎动物模型的实验研究 ［J］．中国寄生虫病防治杂志，1997，10（3）：201－203

［4］ Lanken PN，Minda M，Pietra GG，et al．Alveolar response to experimental Pneumocystis carinii pneumonia in the rat［J］．Am J Pathol．1980，99 （3）：561－588

［5］ 瞿介明，容朝晖，何礼贤．肺孢子菌肺炎表面活性蛋白A和D的变化 ［J］．中华传染病杂志，2000；18（2）：91－94

［6］ Biselli PM，Guerzoni AR，de Godoy MF，et al．Genetic polymorphisms involved in folate metabolism and concentrations of methylmalonic acid and folate on plasma homocysteine and risk of coronary artery disease［J］．J Thromb Thrombolysis．2010，29 （1）：32－40

［7］ 白宏林，李兴．同型半胱氨酸在2型糖尿病微血管病变发病中的作用 ［J］．中国现代药物应用2008，2（22）：41－43

Analysis on HCY Changes in Serum of Rat Infected with Pneumocystis Carinii

LIU Ke－qin1，YIN Wei－dong2，LU Zhi－min2，et al
（1．Department of Clinical Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；2．Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Objective To investigate the pathogenesis on Pneumocystis carinii pneumonia （PCP）．Methods 36female Wister rats were randomly divided into normal group （N group），PCP model group（P group）and TP－SMZ treatment group （S group）．For rats of P and S groups，25mg／Kg dexamethasone was injected in their leg muscle twice a week．H20was injected to rats of N group in the same way to make PCP animal model．From the third week，S group rats，were infused with 250mg／kg d for 5days as a treatment course．In the experiment，infusing treatment course was done once for two weeks and three courses altogether．sICAM－1in serum，pathological changes in the lung and liver and Pc in alveoli of lung were observed．And also pneumocystis carinii （P．C）in alveolar was observed，serum levels of homocysteine（Hcy）were tested and the results wered compared with that of control group （N group）．Results Hcy levels（11．28±1．54）g／L gradually increased after the animal model was constructed，which were higher notably than that in group N （9．46±1．34）g／L （P＜0．01）in 12th week．Though the level（10．58±1．97）g／L tended to increase in S group，there was no significant difference compared with that of N group （9．46±1．34）g／L in 12th week．The results of P group at 9th （10．85±1．33）g／L and 12th week （11．28±1．54）g／L were higher notably than that at 0week （9．38±1．66）g／L（P＜0．05，P＜0．01）．There was no significant difference in S group （P＞0．05）．There was no significant difference（P＞0．05）between P group and S group in Hcy levels．Conclusions After construction of PCP，the serum Hcy levels were significantly increased and it suggested that serum Hcy concentrations were diagnostic marker of microvascular disease for PCP infection．

Pneumocystis carinii；rats；homocysteine

R 519

A

1673－1492 （2011）06－0083－03

来稿日期：2011－10－25

河北省科学技术研究与发展指导计划项目 （编号：052761578）

刘克芹（1968－），女，河北张家口人，副主任技师，主要研究方向：病原生物学．

李蓟龙 英文编辑：谢利锋］