结肠癌手术对肠道菌群微生态的影响

郭世奎，　王昆华，　龚昆梅，　肖　乐，　包维民，　雷　毅，　师　义

结肠癌手术是腹部外科最常施行的术式之一，了解结肠癌患者术前肠道菌群状况和肠道准备及手术创伤对肠道菌群的影响，对指导临床治疗具有重要意义。本研究应用实时荧光定量PCR技术对结肠癌患者手术前后粪便菌群中的拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌和艰难梭菌进行定量分析，比较结肠癌患者手术前后肠道菌群的差异，揭示结肠癌手术处理对肠道相关菌群微生态的影响，为临床治疗提供理论依据。

1　资料与方法

1.1　临床资料

2008年10月至2010年10月我科共收治结肠癌患者60例，男38例，女22例；年龄(65.0±16.4)岁，所有患者均于结肠镜下取材行病理检查证实为结肠癌，其中右半结肠癌21例，左半结肠癌39例，术前均无肠梗阻、肠穿孔及肠炎，无严重全身性疾病等并发症或伴发病，均未行放化疗。所有患者术前1周停用抗生素，术前1天口服复方聚乙二醇电解质散进行肠道准备。手术方式为结肠癌根治术。分别于术前3天和术后停用抗生素7日并恢复饮食后留取标本。

1.2　引物的设计与合成

梭菌属参照Skanseng等的报道[1]，梭杆菌属参照Kato等的报道[2]，肉毒梭菌参照Fach等的报道[3]，坏死梭杆菌参照Jensen等的报道[4]，艰难梭菌参照Denève等的报道[5]。拟杆菌属根据其cfxA基因，脆弱拟杆菌根据其cfiA基因系列设计引物。这7对引物用BLAST进行在线核实其特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物系列见表1。

表1　细菌的PCR扩增引物系列

1.3　试剂与仪器

试剂为细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，普通DNA产物纯化试剂盒(离心柱型)，Real Master Mix(SYBR Green I)，琼脂糖，DNA提取液，DNA分子标准Marker，TaqDNA多聚酶。仪器为Hfsafe-1200TE全排型生物安全柜，超净工作台，低温高速离心机，纯水器，移液器，核酸蛋白检测仪Biophotmeter，温度梯度PCR扩增仪，定量Light Cycler PCR仪。

1.4　粪便细菌DNA的提取

分别于术前3天和术后停用抗生素7日并恢复饮食后取新鲜粪便，用天平称取中段，每份500 mg，收集在标本袋中，置于冰上，取回实验室后-4℃冰箱保存，时间不超过1 h。预处理后，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取粪便细菌DNA，-20℃保存备用。

1.5　常规PCR反应

反应体系25 μL：10×Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(2.5U/μL) 0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 15 μL。95 ℃，预变性5 min，95 ℃变性20 s，拟杆菌属57 ℃、梭杆菌属58 ℃、梭菌属59 ℃、脆弱类杆菌60 ℃、坏死梭杆菌60 ℃、肉毒梭菌61 ℃、艰难梭菌61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40次，72 ℃后延伸5 min，-4 ℃保存。取PCR反应产物6 μL与溴酚蓝2.5 μL混匀上样，将2.0% 琼脂糖凝胶放入1×TAE缓冲液中进行电泳，电压60 V，时间90 min，电泳结束后用凝胶成像分析系统摄像。

1.6　实时荧光定量PCR反应

将待测粪便样品中提取的DNA分别进行7种细菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR反应，反应体系：Real Master Mix：9 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7 μL，反应体积为20 μL，最后加石蜡油 8 μL封帽。反应条件：95 ℃，预变性2 min，循环1次；定量程序：95 ℃变性20 s，拟杆菌属57 ℃、梭杆菌属58 ℃、梭菌属59 ℃、脆弱类杆菌60 ℃、坏死梭杆菌60 ℃、肉毒梭菌61 ℃、艰难梭菌61 ℃退火10 s，68 ℃ 延伸30 s，循环40次；74 ℃，30 s，循环1次，每次实验同时设标准品校正和ddH2O代替DNA模板作为阴性对照，反应完毕后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性，并由Light Cycler PCR仪分析定量结果。

1.7　标准曲线的制作

取粪便基因组DNA用拟杆菌属，梭杆菌属，梭菌属，脆弱拟杆菌，坏死梭杆菌，肉毒梭菌，艰难梭菌引物进行特异性扩增，将出现目的条带的扩增产物按普通DNA产物纯化试剂盒说明进行纯化，纯化产物用核酸蛋白检测仪Biophotmeter测定浓度，并将其换算为各标准品1 μL的拷贝数，即等于6.02×1023×浓度(g/mL)/分子量(g/mol)，其中分子量(g/mol)=扩增片段长度×660，(拟杆菌属3.95×1014，梭杆菌属5.16×1014，梭菌属2.02×1014，脆弱拟杆菌3.76×1014，坏死梭杆菌1.9×1014，肉毒梭菌3.77×1014，艰难梭菌3.62×1014)用于制作标准曲线。将各纯化产物做10倍系列稀释，使之成为(1×108～1×104)copies/mL，作为标准品，进行SYBR Green I 实时荧光定量PCR反应。根据读取的荧光数据，由系统软件自动分析循环阈值(Cycle threshold, Ct)，并生成标准曲线。

1.8　统计学分析

2　结果

2.1　引物特异性检测

用2%琼脂糖凝胶电泳分析常规PCR产物，以Marker为标准。可见常规PCR产物均显示特异性条带，与预期的DNA片段长度相吻合(见图1)。

图1　PCR产物凝胶电泳图

2.2　扩增曲线

不同拷贝数的模板循环数与荧光强度的关系图见图2(以梭菌属为例)，从图中可以看出梭菌属不同拷贝数的模板随循环数的增加，荧光强度逐渐增强，在经过一段指数扩增期后曲线趋于平行，即出现“平台效应”，其定量分析在指数扩增期进行。其他几种细菌也同上。

图2　7份术前标本梭菌属PCR扩增曲线图(显示荧光强度与循环数的关系)

2.3　标准曲线

以对数转换后的拷贝数为横坐标，以定量PCR反应过程中达到荧光阈值的初始循环数为纵坐标得到各细菌的标准曲线(见图3)，为待测样品的定量提供了参照标准。

2.4　溶解曲线

通过对溶解曲线的分析，进一步验证引物的特异性。7种细菌的溶解曲线均为单峰，说明扩增产物单一，以梭菌属为例，与SYBR Green Ⅰ荧光染料结合的为目的DNA片段，见图4。

2.5　PCR扩增产物纯化获得DNA测序结果

测序所得系列与梭菌属基因系列完全一致。说明扩增产物是梭菌属，引物特异性高(见图5)。

图3　术前标本梭菌属的标准曲线图(取104、105、106、107、108制做标准曲线)

图4　7份术前标本梭菌属的溶解曲线，显示产物TM值为88.01℃～89.05℃时引物的特异性好

图5　梭菌属扩增产物纯化获得DNA测序结果

2.6　粪便的细菌定量结果

每份粪便标本所含的7种细菌的拷贝数可通过Ct值与标准品的标准曲线比较得到。结肠癌患者术后粪便中的拟杆菌属、梭杆菌属及梭菌属及脆弱拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌及艰难梭菌数量均较术前明显减少，见表2。

表2　粪便标本细菌定量的结果

注：结肠癌(n=60)手术前、后的比较，用配对t检验，检测7种细菌差异均有统计学意义(P<0.05)

3　讨论

结肠癌是人类常见的恶性肿瘤，人类消化道内约有1014个活细菌，占正常成人粪便重量的60%[6]，由30个属400～500种细菌组成[7]。肠道中细菌的组成、数量及活性，在维持人体健康中起重要作用[8]。本研究通过对结肠癌患者手术前后肠道中的拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌及艰难梭菌进行定量分析，以了解手术前后结肠癌患者粪便菌群的主要变化。结果显示，结肠癌患者粪便中拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌及艰难梭菌的数量在手术后均有明显减少，与手术前比较差异有统计学意义(P<0.05)。有研究显示结肠癌患者肠道菌群出现微生态量的变化可能与结肠癌的复发、发展有关，但机制不明[9]，并且肠道菌群改变时，肠道细菌及其代谢产物作用于基因易感性宿主，使之产生免疫应答，三者在肠癌的开始和持续发展中起到了重要的协同作用[10]。本研究与Tannock[11]的研究一致，与我们前期研究[12]亦一致。因此，根据所确立的患者具体的肠道菌群量的变化，为结肠癌的预防及诊治提供了新视角，并通过检测肠道菌群改变，进行筛查，确定结肠癌高危人群，行饮食干预及相关检查，达到早期诊断，早期治疗的目的。

本研究对于揭示手术处理对肠道菌群的影响，为结肠癌患者术后临床营养支持和相关处理的选择，寻找结肠癌术后最佳治疗方案，以及个体化治疗提供了理论依据和指导意义。

总之，本研究应用实时荧光定量PCR技术，实现了对拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌及艰难梭菌等难培养的肠道细菌进行定量分析，发现结肠癌患者术后上述细菌明显减少，提示结肠癌手术处理对肠道菌群有一定的影响，为围手术期的肠道菌群调理及术后营养支持提供了理论依据[13]。同时，应用实时荧光定量PCR技术为结肠癌患者肠道菌群组成，动态变化及相关的研究提供了一种有效检测手段，为临床诊治结肠癌患者术后肠道菌群失调提供新的视角。

参考文献：

[1]Skanseng B，Kaldhusdal M，Rudi K. Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(5): 269-279.

[2]Kato H, Yoshida A, Awano S, et al. Quantitative detection of volatile sulfur compound-producing microorganisms in oral specimens using real-time PCR[J]. Oral Dis, 2005, 11 (S1): 67-71.

[3]Fach P, Micheau P, Mazuet C, et al. Development of real-time PCR tests for detecting botulinum neurotoxins A, B, E, F producing Clostridium botulinum, Clostridium baratii and Clostridium butyricum[J]. J Appl Microbiol, 2009, 107(2): 465-473.

[5]Denève C, Deloménie C, Barc MC, et al. Antibiotics involved in Clostridium difficile-associated disease increase colonization factor gene expression[J]. J Med Microbiol, 2008, 57(Pt6): 732-738.

[6]Sghir A，Gramet G，Suau A，et a1.Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(5): 2263-2266.

[7]吴承堂，谭建美. 大肠癌术后肠道菌群变化的临床研究[J]. 中华普通外科杂志，2004，l9(6): 334-336.

[8]Ravva SV, Stanker LH. Real-time quantitative PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and differentiation from other mycobacteria using SYBR Green and TaqMan assays[J]. J Microbiol Methods, 2005, 63(3): 305-317.

[9]Rafter J, Bennett M, Caderni G, et a1. Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients[J].Am J Clin Nutr, 2007, 85(2): 488-496.

[10]Rescigno M. The Pathogenic Role of Intestinal Flora in IBD and Colon Cancer[J]. Current Drug Targets, 2008, 9(5): 395-403.

[11]Tannock GW. Molecular methods for exploring the intestinal ecosystem[J]. Br J Nutr, 2002, 87( suppl 2): S199-201.

[12]郭世奎，龚昆梅，包维民，等. SYBR Green I实时荧光定量PCR法分析结直肠癌患者肠道菌群变化[J]. 中国普外基础与临床，2010, 17(5)：463-468.

[13]郭世奎，包维民，龚昆梅，等. 手术处理对结直肠癌患者肠道菌群变化的临床研究[J]. 结直肠肛门外科杂志，2010，16(4)：201-206.