应用HS-SPME技术分析葡萄果皮与果肉挥发性香气物质*

范文来，徐岩，李记明，，姜文广，，于英

1(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学酿酒科学与酶技术研究中心，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡，214122)2(张裕集团公司技术中心，山东烟台，264000)

挥发性香气成分是葡萄中重要的风味物质，其种类繁多，主要包括酸类、醇类、酯类、萜烯类、醛酮类和酚类等［1］。这些成分的种类、含量、感觉阈值及其之间的相互作用决定着葡萄的感官质量，也影响着葡萄酒的风味和典型性［2］。不同葡萄品种，乃至同一品种不同品系、不同成熟期和不同产地之间风味成分存在着差异。蛇龙珠(Cabernet gernischt)、赤霞珠(Cabernet sauvignon)、品丽珠(Cabernet franc)和梅鹿辄(Merlot)葡萄是我国酿造红葡萄酒的主要葡萄品种，我国科研人员对这些葡萄品种的香气研究十分广泛，而对蛇龙珠葡萄的研究相对较少［2－3］。

红葡萄酒发酵是带皮发酵，其主要目的是浸出皮中的色素和丹宁［4］。近期的研究发现，葡萄皮中除了含有大量的色素和丹宁外，还含有大量的风味化合物［5］。Cabaroglu等人研究了麝香葡萄(Muscat)酒的游离与结合态风味，并对浸皮发酵时间进行了研究，发现浸皮发酵时能增加总游离与结合态风味化合物浓度［6］。Sánchez-Palomo 等人应用顶空-固相微萃取(HS–SPME)方法快速检测麝香葡萄的葡萄汁和果皮挥发性成分，发现里哪醇、香叶醇、橙花醇含量最高［7］。Cabrita等人曾经应用酶和酸水解法研究了包括10个葡萄品种(5个白葡萄和5个红葡萄品种)的果皮与果肉的结合态香气成分，认为葡萄果皮比果肉含有更多的香气成分［8］。Murat等人在研究赤霞珠和梅鹿辄葡萄中3-甲硫基-1-己醇(3MH)及其前驱物时发现，该化合物60%存在于葡萄皮中;延长果汁与果皮接触时间可以增加果汁中3MH的浓度，温度升高有利于3MH的浸出［9］。

由于大多数的挥发性物质在葡萄中的含量很低，因此在应用色谱-质谱技术对其进行定性、定量分析前，有必要采用适宜的浓缩富集手段对样品进行预处理。传统的富集手段包括液液萃取［10］、固相萃取［11］、顶空技术［12］、吹扫捕集技术［13］、超临界流体萃取［14］和溶剂蒸馏萃取［15］等。这些预处理手段都存在一定的缺点，有些耗时费力，有些涉及到有毒的有机溶剂，有些需使用昂贵的设备［16］。1990年，Pawliszyn等人［17］研发出了固相微萃取技术(简称SPME)。目前，该技术已经在酒类分析检测中得到广泛应用［2，18－19］。

与国外略有不同的是，我国酿酒葡萄以蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠和梅鹿辄为主，特别是我国特有的品种蛇龙珠研究较少。为明晰我国主要酿酒葡萄的风味成分，特别是果皮与果肉的风味成分，应用 HSSPME技术对这4种葡萄的果皮与果肉成分进行研究，以便对红葡萄酒的浸皮发酵提供技术指导，提高我国国产葡萄酒的品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

1.1.2 试剂

主要试剂包括乙酸乙酯(99%)，丁酸乙酯(99%)，2-甲基丁酸乙酯(99%)，正丁醇(99%)，3-甲基丁醇(99%)，己酸乙酯(99%)，己醇(99%)，顺-3-己烯-1-醇(99%)，辛酸乙酯(99%)，乙酸(99%)，2-乙基-1-己醇 (99%)，苯甲 醛 (99%)，正 辛醇(98%)，癸酸 乙酯 (99%)，萘 (99%)，苯乙 酮(99%)，苯甲酸乙酯(99%)，正癸醇(98%)，香茅醇(98%)，己酸 (99%)，苯甲醇 (99%)，γ-壬内酯(98%)，对乙基苯酚(98%)，3-甲基丁醛(97%)，乙偶姻(98%)，1-辛烯-3-醇(98%)，里哪醇(98%)，顺，反-2，6-壬二烯醛(98%)，4-萜品醇(99%)，苯乙醛(97%)，正壬醇(98%)，α-萜品醇(98%)，2-羟基苯甲酸甲酯(97%)，β-苯乙酸乙酯(99%)，茴香脑(97%)，β-大马酮(98%)，β-紫罗兰酮(99%)，苯酚(98%)，4-甲基苯酚(96%)，苯甲酸(97%)，香草醛(98%)和乙酰香草酮(98%)购自Sigma-Aldrich公司(St．Louis，MO，USA)。2-辛醇 (96%)，异戊酸(98%)，2-苯乙醇(99%)购自 Fluka 公司(Bush，Switzerland)。异丁酸(99%)购自 Alfa Aesar公司(Ward Hill，MA，USA)。辛酸(98%)购自吴江慈云香料香精有限公司。乙醇购自美国 TEDIA试剂公司，液相色谱纯。己醛(98%)，癸醛(99%)购自北京北大正元科技有限公司。

1.2 仪器与设备

6890N-5975气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司;50 μm/30 m CAR/DVB/PDMS(2 cm)萃取头，美国Supelco公司;SPME手动进样手柄，美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

1.3.1.1 葡萄果皮

取－20℃储藏的葡萄样品100 g，在冷冻状态下用手拨下葡萄皮，用去离子水轻轻冲去果皮上附着的果肉和果汁，用滤纸吸干葡萄皮上的水分。称取2 g葡萄皮装入50 mL的磨口三角瓶中，再加入10 mL模拟葡萄汁(煮沸去离子水中用酒石酸调pH3.5)，超声波浸取一定时间，然后取8 mL葡萄汁到15 mL的棕色顶空瓶中，加 2.4g NaCl、4 μL 2-辛醇(内标)，盖紧顶空瓶盖，用于GC-MS检测。

1.3.1.2 葡萄果肉

在互联网社会，其最突出的特点就是整合了产业链的各种特色。以运营商为中心，产业链中的每一个厂商都有属于自己的业务，同时也在向上游、下游延伸和渗透，每个厂商的定位越来越模糊。而诺基亚却没能够抓住这一点，其没有主动与产业链中的各个环节主动合作，也就没能形成自己的影响力。

取－20℃储藏的葡萄样品100 g，在冷冻状态下用手拨下葡萄皮，果肉中加1 g CaCl2和少许液氮进行破碎，破碎后4℃下5 000 r/min离心10 min，然后取8 mL葡萄汁加入到15 mL的棕色顶空瓶中，加2.4 g NaCl和 4 μL 2-辛醇(内标)，盖紧顶空瓶盖，用于GC-MS检测。

1.3.2 标准溶液配制

准确称取一定量标准品配制到无水乙醇(优级纯，上海国药集团)中配成一定浓度的标准样品，再加入到模拟葡萄汁中配制成一系列浓度的标准混合溶液。模拟葡萄汁采用煮沸的去离子水配制，用酒石酸将pH值调整到3.5。内标溶液为2-辛醇溶于无水乙醇中。

1.3.3 HS-SPME与定量方法

HS-SPME萃取条件与定量方法采用Fan等人的方法［2］，萃取时采用 CAR/DVB/PDMS三相萃取头，预热5 min，60℃下萃取45 min。

1.3.4 GC-MS

GC条件:色谱柱为DB-Wax(30 m ×0.25 mm× 0.25 μm，Agilent)。进样口温度 250℃，载气 He，流速2 mL/min，检测器温度250°C。程序升温:初始温度50°C保持1 min，以6°C/min的速度升温至230 °C，保持 15 min，溶剂延迟3 min。

MS条件:EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 °C，扫描范围33.00～500.00 amu。

1.3.5 甲氧基吡嗪检测方法

甲氧基吡嗪的测定参照文献［20］。

1.3.6 物质鉴定及定量分析

物质定性采用将未知物的图谱与NIST Library和Wiley Library库相比较，保留匹配度大于800(最高值为1000)的物质作为化合物定性鉴定结果。除此以外，检索结果还与已报道的保留时间进行对比验证。

定量时每种待测物质分别对应于内标作标准曲线，经过GC-MS检测后利用待测物质和内标的相对峰面积比代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。每种待测物质的峰面积采用选择离子方法积分(SIM)。

2 结果与讨论

2.1 葡萄果皮中风味物质超声波辅助萃取

果皮中含有大量风味化合物，但浸出困难。为缩短浸出时间，采用超声波辅助浸出，样品分别超声10、20、30和40 min，研究超声时间对浸出效果的影响。结果如图1所示，在20 min后香气成分的总峰面积基本趋于平衡。因此，果皮浸出时间设定为超声波辅助萃取20 min。

图1 葡萄果皮超声浸提时间的优化

2.2 葡萄果皮与果肉风味化合物总量

在4种葡萄中，果皮中的化合物总量高于果肉中的化合物总量(见表1)，这一结果与 Selir［21－22］和 Cabrita［8］的研究结果是一致的。就研究的10类化合物总量而言，果皮的含量是果肉的1.64～21.07倍。果皮中含有较多的酯类、芳香族化合物、挥发性有机酸和挥发酚，这些化合物果皮比果肉中高出10倍以上。

不同品种的葡萄中，果皮中高含量化合物是不一样的。在所研究的4种葡萄中，赤霞珠葡萄果皮中化合物含量较高，而蛇龙珠葡萄的果皮与果肉成分相差较小。梅鹿辄葡萄的果皮中含有较多的酯类与芳香族化合物;赤霞珠葡萄果皮中含有大量的挥发性有机酸和挥发酚;品丽珠葡萄中含有较多的挥发酚、芳香族化合物和挥发性有机酸;而蛇龙珠葡萄果皮中主要是芳香族化合物。

表1 四种葡萄果皮与果肉风味化合物浓度比

2.3 葡萄果皮与果肉中的主要挥发性风味化合物

不同的风味化合物在葡萄果皮与果肉中含量差别较大。葡萄果皮中含有较多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛醛、癸醛、异戊醇、苯甲醛、萘、乙酰苯、水杨酸甲酯、乙酸、里哪醇、茴香脑、己醛、2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇、苯酚和 3-异丁基-2-甲氧基吡嗪(见表2)。

表2 四种葡萄果皮和果肉中香气成分的含量(g/100 g)

续表2

不同品种葡萄果皮中主要风味成分浓度是不一样的。梅鹿辄葡萄果皮中含有较多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯，是果肉的10倍以上;赤霞珠与品丽珠葡萄皮中含有较多的乙酸;梅鹿辄与赤霞珠葡萄皮中含有较多的癸醛，而品丽珠葡萄皮中含有较多的辛醛;梅鹿辄与品丽珠葡萄皮中含有大量的异戊醇;苯甲醛主要存在于梅鹿辄、赤霞珠和品丽珠葡萄的皮中;而乙酰苯和水杨酸甲酯主要存在于梅鹿辄、品丽珠与蛇龙珠葡萄果皮中，果肉中相对较少。对萜烯类化合物而言，里哪醇大量存在于赤霞珠葡萄的果皮中，而茴香脑、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、萘在研究的4种葡萄皮中含量远高于果肉(10倍以上)。3-异丁基-2-甲氧基吡嗪主要存在于品丽珠与蛇龙珠葡萄果皮中。

3 结论

通过对蛇龙珠、赤霞珠、梅鹿辄和品丽珠4种葡萄果肉和果皮中香气成分的定量和定性分析，结果表明果皮中各香气成分的含量大约是果肉中的1.58～20.54倍左右。果皮中含有较多的酯类、芳香族化合物、挥发性有机酸和挥发酚。

与果肉成分相比，梅鹿辄葡萄果皮中主要含有辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、癸醛、异戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水杨酸甲酯和2-己烯醛。赤霞珠葡萄皮中含量高的化合物有癸醛、苯甲醛、乙酸、里哪醇和顺-3-己烯-1-醇。品丽珠葡萄皮中主要有辛醛、异戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水杨酸甲酯、乙酸、2-己烯醛和3-异丁基-2-甲氧基吡嗪;而蛇龙珠葡萄果皮中主要是水杨酸甲酯、茴香脑、己醛、2-己烯醛和3-异丁基-2-甲氧基吡嗪。茴香脑、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、苯酚、萘在研究的4种葡萄皮中含量远高于果肉。

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