低湿度培养诱生变形杆菌复杂群集运动增殖生长模式

刘艳霞，刘蕾，刘俊康，邓渝

(第三军医大学医学检验系生物波研究中心，重庆400038)

变形杆菌(Proteus mirabilis)被用作模拟微生物和其他复杂自身机化系统(self-organizing systems)的模式系统(model system)，同时变形杆菌也是一种生物系统实例，在该生物系统中，局部动力-分期结构决定系统的立体动力。对变形杆菌的研究与其他系统有相似的关联性，如肿瘤生长，以及年龄、体积、肿瘤和免疫细胞的激活水平等生理学构造和过程，对评价系统空间行为具有重要作用［1］。本研究探讨低湿度培养环境对变形杆菌集群运动生长模式的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis，PM)由本实验室保存。

1.1.2 培养基LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，各成分溶于蒸馏水，调pH至7.2～7.4，加入2.5%琼脂，高压灭菌。临用前加入0.05%三苯基四氮唑(TTC)及0.1%葡萄糖，制成平板。

1.2 方法

1.2.1 平板含水量测定将已经高压灭菌的LB培养基溶化，待其温度降至50℃左右按比例加入TTC、葡萄糖混匀，制板，室温冷凝，37℃、倒置、敞口烤板，0 h称重(M0)、0.5 h称重(M0.5)、2.5 h称重(M2.5)，2.5 h后37℃、正置、敞口烤板至干，恒重后称重(M∝)，设0 h含水量(H)为100%，计算0.5 h及2.5 h的平板相对含水量：

1.2.2 低湿度诱导培养将已经高压灭菌的LB培养基溶化，待其温度降至50℃左右按比例加入TTC、葡萄糖混匀，制板，室温冷凝，37℃倒置、敞口、无菌烤板2.5 h，中心点种奇异变形杆菌37℃培养3 d。平行培养3皿。

1.2.3 不同区域菌体传代培养如1.2.1方法制备培养平板，37℃倒置、敞口、无菌0.5 h，同一平板中对称点种外环菌与内环菌37℃培养24 h。连续培养3代，计算菌落直径比值反应集群运动增殖速率差异。

1.2.4 不同区域菌体革兰染色取培养24 h的第3代菌的最外沿菌体，涂片固定，草酸铵结晶紫染色1 min，自来水冲洗，加碘液覆盖涂面染色1 min，水洗，吸水纸吸去水分，加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30 s后水洗，吸去水分，蕃红染色液(稀)染色10 s后，自来水冲洗，干燥，油镜下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 平板含水量测定结果

平板含水量测定结果见表1。

表1 平板含水量测定结果Table 1 Flat water content results

2.2 奇异变形杆菌在低湿度培养基诱导培养观察结果

初始阶段同贾雄飞等［2］报道的方式增殖，色环间距、环扩增时间小于其报道，后出现环间距增大的菌群(图1)。环间距小的为内环菌，间距大的为外环菌。

图1 低湿度诱导培养结果Fig.1 Result of low humidity induced culture

2.3 不同区域菌体传代培养观察结果

由菌落直径可见，内环菌菌落直径较小，外环菌菌落直径较大(图2)，显示出不同的增殖和迁移能力。菌落直径比值见表2，可见外环菌集群运动增殖速率大于内环菌，且有随着培养代数增多差异增大的趋势。

图2 不同区域菌体传代培养观察结果Fig.2 Results of different regions of the cell subculture

表2 菌落直径比值(¯±SD，n=9)Table 2 The ratio of colony diameter(¯±SD，n=9)

表2 菌落直径比值(¯±SD，n=9)Table 2 The ratio of colony diameter(¯±SD，n=9)

注：*P＜0.01与第1代比较

第1代第2代第3代菌落直径比1.83±0.173.71±0.12*4.51±0.12*

2.4 不同区域菌体革兰染色结果

革兰染色结果(图3)显示内环菌与外环菌均为革兰阴性菌，内环菌短杆状居多，外环菌菌体长杆状或丝状居多。

图3 不同区域菌体革兰染色结果(1 000×)Fig.3 Gram stain results of different regions of the bacterial(1 000×)

3 讨论

对变形杆菌的研究与肿瘤生长等系统及年龄、体积、肿瘤和免疫细胞的激活水平等生理学构造和过程有相似的关联性，对评价系统空间行为具有重要作用。Bruce P.Ayati［1］在Esipov和Shapiro提出的变形杆菌细胞周期动力学的数学描述的基础上，提出一种分期和空间上连续的结构模型，计算变形杆菌的群体增殖生长，反应实验中观察到的时间和空间上的规律性。

本研究室在研究中发现，改变培养环境可影响变形杆菌的集群增殖生长模式，直观反应环境对系统的影响。Howard C.Berg［3］指出鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)在营养丰富的软琼脂表面菌体延长，生长出更多的鞭毛，并以协同运

动的方式布满琼脂表面，当琼脂表面干燥时，鞭毛分泌的由抗δ因子控制的鞭毛合成晚期基因分泌减少，菌体的鞭毛短，集群运动性减弱。本研究探讨低湿度对变形杆菌集群运动增殖生长模式的影响，结果表明低湿度环境不利于变形杆菌的集群运动增殖，同时又可诱生出高迁移能力的菌体，从而使其群集增殖生长模式复杂化，直观反映了一种环境变化即可对系统产生巨大的影响。

［1］ Ayati BP.A structured-population model of Proteus mirabilis swarm-colony development［J］.J Math Biol，2006，52(1)：93-114.

［2］ 贾雄飞，刘俊康，徐启旺.奇异变形杆菌周期性群集运动的研究［J］.第三军医大学学报，2005，27(9)：868-870.

［3］ Berg HC.Swarming motility：it better be wet［J］.Curr Biol 2005，15(15)：R599-600.