吉林地区HFRS病原体基因型分析

赵臣，赵阳，李艳，袁忠海，孙可歆，张磊，罗恩杰

(1.吉林医药学院检验系，吉林吉林132013;2.中国人民解放军第二二二医院传染科，吉林吉林132012;3.中国医科大学病原生物学教研室，辽宁沈阳110001)

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(hantavirus，HV)感染引起的一种自然疫源性传染病［1］。HV属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，为分节段的单股负链RNA病毒，病毒基因组有大(L)、中(M)、小(S)3个片段组成，已经发现30个血清型，分布在世界各地。其中，引起HFRS的主要为汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、普马拉病毒(PUUV)和多布拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)，我国的HFRS主要是HTNV和SEOV为主引起。吉林省是HFRS的老疫区和重疫区，累计发病近4万例［2］。吉林市及所属各县市是吉林省HFRS的重疫区，近年来，吉林地区HFRS发病率呈明显上升趋势。1998年，吉林地区磐石市曾发生家鼠型HFRS小规模流行，2005～2006年再次出现家鼠型HFRS爆发流行［2-3］。以往报道中，吉林地区HFRS病原体主要以HTNV和SEOV为主，但近年来，不断有汉坦病毒发生变异的报道［4-5］，尤其是2003年以来，吉林省抚松地区发现HV亚型PUUV的流行［6-7］(该病毒于2007年在瑞典引起了大范围的暴发流行［8］)，为验证在吉林地区是否同样存在PUUV，从而使HFRS发病率上升、临床表现有所改变，有必要针对吉林地区进行流行病学调查，对临床确诊的HFRS病人进行系统的研究，明确流行于吉林地区的汉坦病毒流行株的型别，为制订有针对性的防治策略以及为新型疫苗的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2009秋冬至2010年冬春季，在吉林市船营区、丰满区、龙潭区、昌邑区、磐石市、蛟河市、桦甸市、永吉市、舒兰市捕捉褐家鼠，取鼠肺组织，冰冻切片后用IFA检测，汉坦病毒抗原阳性的标本用于RT-PCR扩增。

1.2 方法

1.2.1 标本中病毒抗原的检测鼠肺组织进行常规冰冻切片，用冷丙酮于4℃固定30 min后，用HFRS病人恢复期血清作为第一抗体，FITC标记的羊抗人IgG作为第二抗体(Sigma公司)进行间接免疫荧光实验检测病毒抗原。其中，阳性对照为用普马拉病毒K27株感染的Vero E6细胞做的抗原片，阴性对照为用正常Vero E6细胞做的抗原片。

1.2.2 病毒RNA提取参照GIBCO公司的Trizol RNA提取试剂使用说明书进行。最后加入DEPC水40 μL溶解，-70℃保存。

1.2.3 巢式RT-PCR及PCR产物的纯化和回收

使用SuperscripTMⅡ逆转录酶和汉坦病毒属特异引物P14，按说明书合成cDNA。参照已发表的HV引物设计HTNV、SEOV、PUUV S片段通用外引物和分型引物，设计引物见表1。常规进行巢式PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切下特异分子量条带，用回收试剂盒纯化回收，纯化后的PCR产物，再次PCR检测。循环参数为94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30个循环。PCR产物溶于20 μL去离子水中，-20℃保存。

1.2.4 PCR产物序列测定和分析从GenBank中选择汉坦病毒各型代表株序列，应用Clustal W方法进行序列比较绘制系统进化树。用MEGA 3.1软件进行序列比较分析，绘制系统发生树。使用DNASTAR软件包进行序列同源性分析。

表1 巢式RT-PCR引物设计Table 1 Primer of Nested RT-PCR

2 结果与分析

2.1 宿主动物调查及病原检测结果

本研究共捕获各种鼠类共102只(吉林市区60只，吉林市所属各县市区42只)，IFA检测HV阳性鼠共4只(均为褐家鼠)，总阳性率为3.92%。其中吉林市船营区阳性鼠1只，阳性率为1.67%;吉林市所属磐石市阳性鼠2只，阳性率为4.76%;舒兰市阳性鼠1只，阳性率为2.38%。

2.2 汉坦病毒的分型结果

经HTNV、SEOV、PUUV特异性引物扩增结果显示，4份HV抗原阳性鼠肺组织标本均为SEOV型，扩增产物398 nt(见图1)。其中吉林市船营区1份(编号JL001);吉林市所属磐石市2份(编号JL002、JL003);舒兰市1份(编号JL004)。

图1 汉坦病毒分型检测结果Fig.1 RT-nested PCR products of Seoul virus

2.3 SEOV S基因片段核苷酸序列的同源性和进化分析

从4份阳性标本中共扩增出4份S片段的核苷酸序列。同源性分析发现，4份S基因片段核苷酸序列之间的同源性为98.5%～100%，与Panshi Rn74、Shuangyang Rn193、heilongjiang zy27、heilongjiang Pf26等S3亚型病毒株的同源性最高，为95.2%～99.8%;与S1亚型之间的同源性为91.8%～94.6%;与从黑线姬鼠分离到的标准株76～118的同源性为61.3%～68.9%。用部分S基因片段核苷酸序列构建的系统发生树，见图2。由图2可知，吉林市船营区1只褐家鼠所携带病毒(JL001)与heilongjiang zy27株亲缘关系最近;吉林市所属磐石市2只褐家鼠所携带病毒(JL002、JL003)与Panshi Rn74及Shuangyang Rn193株亲缘关系最近;吉林市所属舒兰市1只褐家鼠所携带病毒(JL004)与heilongjiang Pf26株亲缘关系最近。且4株病毒均在同一分支，同属于S3亚型。

图2 SEOV S基因片段核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of S segment of Seoul viruse

3 讨论

HV引起人类的HFRS，其病原体是HTNV、SEOV、DOBV和PUUV［3］。我国历来以SEOV、HTNV为主，但是近年来不断发现SEOV、HTNV的变异株，2003年在吉林省抚松地区又发现了PUUV，加之HFRS病人临床症状愈发“不典型”化，表明现阶段我国HFRS病原体已经出现了新的变化。

在本研究中，在吉林市所属各县市区102只褐家鼠中发现HV阳性鼠共4只，用SEOV特异引物以巢式RT-PCR在4份褐家鼠标本中扩增到目的片段，但用HTNV及PUUV的特异引物没有扩增到目的片段。扩增出的SEOV S基因片段与HTNV 76-118标准株的同源性低于75%。因此，在吉林市地区褐家鼠中流行的病毒为SEOV，与鄢燕贞等［9］的研究结果一致。

本研究中，4份SEOV S基因片段与S3亚型病毒株的同源性高于95%，与S1、S2、S4、S5亚型的汉城型汉坦病毒的同源性低于95%。在用S基因片段核苷酸序列构建的系统发生树中，吉林市地区褐家鼠携带的4份SEOV与已知的辽宁省、黑龙江省及吉林省已确定的HV毒株同在S3亚型分支上。因此，吉林市地区褐家鼠携带的汉城型汉坦病毒为S3亚型，也呈现出HV分布的地理聚集现象［10］。

本研究没有发现吉林市地区有PUUV存在，可能存在3个原因：一是吉林市地区没有PUUV病毒流行分布;二是由于取材范围小，样本少，没有检测到阳性鼠;三是PUUV的宿主一般为棕背鼠平，褐家鼠体内没有PUUV存在，因此检测呈阴性结果。

总之，本研究表明吉林市地区褐家鼠中流行的病毒为SEOV，为S3亚型。但由于HV的地理分布特点和宿主特异性等原因，会导致分析结果出现误差，因此上述研究结果还有待于进一步研究证实，在今后的研究中还将做进一步探讨。

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