白蚁共生放线菌的抗菌活性筛选及菌株BY02的初步鉴定

胡松英，张应烙，2*，黄娟翠，方郑，黄如柏，向婷婷

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004;2.南京大学医药生物技术国家重点实验室，江苏南京210093)

放线菌是产生抗生素最多的一类微生物，目前世界上已经发现的抗生素80%是由放线菌产生的，但研究放线菌的对象长期集中在来自土壤、水体等环境微生物，从中分离得到的化合物往往是已知化合物，出现全新骨架活性化合物的几率已经很低，趋同的环境和重复的研究使得新天然药物的发现率从上世纪80年代开始逐年下降。但与此同时，近年来在制药领域的进步也使得人们对药用活性物质的来源与特性有了更高的要求，已有结构特征的化合物不能适应病原的快速变化，而传统来源的天然产物发现的途径也难以满足具有新结构特征或新作用特点化合物发现的需要。因此，为了发现新型天然药源分子，寻找新的特境微生物资源显得尤为必要。昆虫共生菌是一类研究较少的特境微生物，是新颖天然产物的广泛来源［1］。在较系统研究大刀螳螂、棉蝗和负蝗共生菌活性代谢产物的基础上［2-4］，活性筛选表明1株黑翅土白蚁共生放线菌具有较好的抗菌活性，本文报道该活性菌株并初步确定其分类地位，旨在为开发新型微生物源杀菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集供试黑翅土白蚁采自浙江师范大学校园内。

1.1.2 供试植物致病菌供试植物致病菌为:苹果腐烂病菌(Valsa mali)、杨树溃疡病菌(Dothiorella gregaria)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)，均由西北农林科技大学植物病理研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 共生放线菌的分离及其发酵产物的提取

利用平板分离法从黑翅土白蚁中分离到10株共生放线菌［4］，将分离到的10株菌株分别接种于

装有50 mL高氏一号培养液的250 mL的三角瓶中，30℃、150 r/min条件下，摇床培养7 d。所得发酵液经6～8层纱布过滤，滤液分别用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经减压浓缩得粗浸膏。用丙酮定容，使粗浸膏最终质量浓度为1.0 mg/mL。

1.2.2 BY02发酵产物不同极性物质的提取参照1.2.1，对BY02进行液体发酵并得到发酵滤液，滤液依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液经减压浓缩得二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。用丙酮定容，使各提取物最终质量浓度均为1.0 mg/mL。

1.2.3 共生放线菌提取物抑菌活性测定采用生长速率法测定发酵提取物对植物病原菌的抑制活性［2］，具体操作过程参照冯俊涛等［5］方法。带毒培养基的制备:取所制备的白蚁共生放线菌提取物1 mL于灭菌的10 mL试管中，加入9 mL 50℃左右PDA培养基，摇匀，倒入灭菌培养皿中即成，使带毒培养基中提取物的最终质量浓度为0.1 mg/mL，以等量丙酮作为阴性对照。将活化的植物病原菌用无菌平板打孔器打成直径5 mm的菌块，置于培养基上，每处理3次重复，培养7 d后，采用十字交叉法测量供试菌菌落直径。按如下公式计算抑制率:抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5 mm)×100%。

1.2.4 BY02菌株鉴定①BY02形态特征观察:采用插片法，将菌种接种于高氏合成一号培养基上，30℃插片培养6～15 d后，取插片在高倍镜下观察菌丝及孢子丝的形态特征，按照《链霉菌鉴定手册》对菌株进行初步鉴定［6-7］;②16S rRNA基因序列分析:用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取样品的基因组DNA，采用通用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1 540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')按照常规方法进行PCR扩增。PCR扩增程序为:98℃5 min，95℃35 s，55℃35 s，72℃1 min，35个循环，延伸8 min。PCR产物经纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。获得的16S rRNA序列提交GenBank并获取登录号。对菌株的16S rRNA序列进行BLAST比对，选取相似序列，利用MEGA 4.0软件构建系统进化树，根据菌株的形态和16S rRNA序列分析结果初步确定菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 10株共生放线菌提取物对3种植物病原菌菌丝生长的抑制作用

10株共生放线菌提取物对3种病原真菌菌丝生长抑制作用结果见表1。在供试质量浓度为0.1 mg/mL时，10株共生放线菌提取物对所有3种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用;BY02提取物的抑菌活性最好，对所有供试菌抑制率均在80%以上，其中对苹果腐烂病菌表现强烈抑制作用，抑制率为100%;BY01和BY06抑菌活性次之，对所有供试菌抑制率均在40%以上，其中对苹果腐烂病菌也表现强烈抑制作用，抑制率为100%。

表1 10株共生放线菌提取物对植物病原菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibiting effect of extracts from ten actinomycete strains on hypha of plant pathogens

2.2 BY02发酵产物不同极性物质对3种植物病原菌菌丝的生长抑制作用

BY02发酵产物不同极性物质对3种病原菌菌丝的生长抑制作用结果见表2。从表中数据可看出，BY02发酵产物的乙酸乙酯提取物活性最好，对所有3种供试菌的抑制率均大于80%;BY02发酵产物的二氯甲烷提取物抑菌活性次之，对2种供试菌的抑制率均大于70%，BY02发酵产物的正丁醇提取物抑菌活性最差，仅对1种供试菌的抑制率大于70%。上述结果表明BY02发酵产物抗菌活性物质主要集中在中等极性部分。

表2 BY02发酵产物不同极性物质对植物病原菌菌丝的生长抑制作用Table 2 Inhibiting effect of different polar fractions from the strain BY02 on hypha of plant pathogens

2.3 BY02菌种鉴定

2.3.1 形态特征观察在高氏1号固体培养基上，BY02的菌落干燥，质地致密，与培养基结合紧，呈颗粒状。采用插片法培养，镜检发现该菌株的基内菌丝和气生菌丝都发育良好，基内菌丝无横隔，不断裂，颜色为黄褐色，不产生孢子，产生黄色的可溶性色素;气生菌丝弯曲、白色，气生菌丝上产生螺旋状孢子丝，孢子圆形。这些特点都与链霉菌的特征相符，初步鉴定该菌株为链霉菌属(Streptomyces)放线菌。

2.3.2 16 S rRNA序列分析BY02的基因组DNA电泳图谱及16S rRNA扩增产物电泳图谱见图1和2，BY02的基因组DNA片段在10 000 bp左右，其16S rRNA扩增产物为1 418 bp，该菌的16S rRNA基因序列已登录于GenBank，获取的登录号为JF412027。菌株BY02与Streptomyces parvulus(AB184326)的同源性达99.5%，亲缘关系最近，在系统发育树上处于同一分支(图3)。故将BY02菌株初步鉴定为Streptomyces parvulus。

图1 菌株BY02的基因组DNA电泳图Fig.1 Electeophoresis of BY02 genome

图2 菌株BY02 PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electeophoresis of result by PCR of BY02

图3 基于16S rRNA基因序列构建的菌株BY02与链霉菌属相关菌株之间的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of BY02 and representatives

3 小结与讨论

本研究从黑翅土白蚁共生放线菌中筛选分离得到1株具有较好抗菌活性的菌株BY02，其抗菌活性物质主要集中在中等极性部分，经形态学观察和16S rRNA序列分析初步确定该菌株为Streptomyces parvulus。如前言部分所述，昆虫共生菌是新颖天然产物的广泛来源［1］，进一步对菌株BY02的次生代谢产物研究，将有希望从中发现结构新颖的抗菌先导化合物，BY02作为微生物源杀菌剂值得进一步研究。

［1］ 张应烙.昆虫肠道真菌的新活性物质研究［D］.南京大学博士学位论文，2008.

［2］ Zhang Y L，Kong L C，Jiang D H，et al.Phytotoxic and antifungal metabolites from Curvularia sp.FH01 isolated from the gut of Atractomorpha sinens［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):3575-3577.

［3］ Zhang Y L，Ge H M，Li F，et al.New phytotoxic metabolites from Pestalotiopsis sp.HC02，a fungus residing in Chondracris rosee gut［J］.Chemistry and Biodiversity，2008，5(11):2402-2407.

［4］ Zhang Y L，Ge H M，Zhao W，et al.Unprecedented immunosuppressive polyketides from Daldinia eschscholzii，a mantis-associated fungus［J］.Angewandte Chemie International Edition，2008，47(31):5823-5826.

［5］ 冯俊涛，石勇强，张兴.56种植物抑菌活性筛选试验［J］.西北农林科技大学学报，2001，29(2):65-68.

［6］ 中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册［M］.北京:科学出版社，1975.

［7］ 阎逊初.放线菌的分类和鉴定［M］.北京:科学出版社，1992.