N1，N5-二（1-甲基咪唑 -2-酰基）二乙基三胺的合成与表征

周成勇，张宝秀

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

N1，N5-二（1-甲基咪唑 -2-酰基）二乙基三胺的合成与表征

周成勇，张宝秀

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

文章首次报道了一种含咪唑环多胺类化合物N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺的合成方法，以此化合物为基础，可以合成对称平行的发卡式多酰胺分子，以期对DNA序列进行新的特异性识别，从而开发研制新型有效的工具酶或抗癌药物。合成方法简便易行、耗时短、不需要过柱分离，每一步合成都有较高的产率。

咪唑；二乙基三胺；多胺；化学核酸酶

1 引言

核酸断裂与基因重组技术是分子生物学和基因工程的核心技术，其中DNA、RNA的定位断裂又是该技术的关键。限制性内切酶能在特定位点切割DNA分子，但其识别位点仅为4～8个核苷酸，且只能在数目有限的位点断裂DNA，给基因工程技术带来一定限制。化学合成的DNA、RNA定位断裂工具是国际上在二十世纪八十年代兴起的一类新型非酶断裂工具，称为化学核酸酶（chemical nucleases）。它们既具有限制性内切酶的高度专一性，又能在人们预先设计的任何位点断裂DNA和RNA，且制备简便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制，在新型抗肿瘤、抗爱滋病化学药物的定向设计及其基因治疗，基因工程研究中基因分离、大片段基因序列分析，染色体图谱分析及DNA定位诱变，分子印记技术（footprinting），DNA的构象识别等方面均有重要意义和应用前景[1，2]。随着遗传工程及分子生物学技术的不断发展，人们越来越不满足于限制性内切酶的应用，化学合成的核酸断裂工具越来越引起人们的重视。

化学核酸酶从结构上大致分为两部分。一是DNA识别结合系统。在生物体内DNA序列的特异性识别常通过蛋白质与DNA的相互作用实现。但由于蛋白质分子具有量大、含量低、结构复杂且容易变性等特点，研究起来十分困难，因而寻找新的简单有效的方法来特异性识别DNA序列，实现有目的的基因调控就具有十分重要的意义。目前用于识别DNA序列的非生物分子主要有寡聚核苷酸、寡聚核苷酸类似物——多肽核酸（PNA）[3]、多胺类化合物等。特别是多胺类化合物的研究，在美国加州理工大学Dervan教授的带领下，近些年来取得了令人瞩目的成果。迄今为止，科学家们成功地合成了一系列各种结构的、对DNA具有特异性识别功能的多胺分子。缩聚单体除N-甲基吡咯（Py）外，还有N-甲基咪唑（Im）、N-甲基-3-羟基吡咯（Hp）、噻唑、呋喃、苯环、嘧啶、嘌呤等[4-7]。结构形式有链状、发卡式、环状等[8-13]。不同结构的多酰胺分子可识别不同的碱基对，根据Dervan总结的规则：Py/Im对C·G碱基对（C：cytosine胞嘧啶，G:guanine鸟嘌呤）进行识别，Im/Py识别G·C碱基对，Py/Py识别 A·T和 T·A碱基对（A：ademine腺嘌呤，T:thymine胸腺嘧啶），Py/Hp识别A·T碱基对，Hp/Py识别T·A碱基对[9]。二是DNA的切割系统。DNA的切割从断裂机理上可分为光切割、氧化切割和水解切割。（1）光切割是指切割试剂在光照下产生自由基使DNA发生断裂。（2）氧化切割是指金属配合物在双氧水或分子氧存在的情况下，由还原剂活化导致核酸中戊糖环的断裂，断裂产物不能被重新克隆。（3）水解切割是指断裂试剂使DNA骨架中的磷酸二酯键发生水解断裂，并不破坏戊糖环，断裂产物可被重新克隆。无论是氧化切割还是光切割，对DNA既无选择性，断裂产物也不能用连接酶进行连接，而且氧化切割还以破坏戊糖环为代价；而DNA的水解切割反应条件温和，可在近生理条件下进行，且断裂产物可用连接酶进行重新连接。因此发展高效、选择性强、能有效水解断裂核酸中磷酸二酯键的化学核酸酶具有非常之意义。

杨频教授[14]等曾利用主族元素Mg为中心的双核金属配合物[Mg2（dien）Cl（OH）]Cl2·2H2O（dien：二乙基三胺）在近生理条件、不加任何其它外来物质的情况下，对PBR322DNA实现了有效切割。加入H2O2、还原剂（如DTT，抗坏血酸）及羟基自由基驱除剂（如DMSO，丙三醇）对反应基本无影响；无氧条件下仍可高效切割DNA。断裂产物线形DNA可被T4连接酶有效连接。这都证明该断裂是由于DNA磷酸骨架水解所致[14]。因此，本文选择Im/Im作为DNA的识别系统；选择二乙基三胺作为水解切割DNA的功能基，然后将其与DNA的识别系统进行连接，合成了一种对称平行的多胺分子-N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺，以期对DNA序列进行新的定位切割，从而研制新型有效的化学核酸梅和抗癌药物。

2 实验部分

2.1 主要实验仪器和试剂

（1）熔点测定：数字式熔点仪（上海物理光学仪器厂）。

（2）1H NMR与13C NMR谱：DRX300MH超导核磁共振仪（瑞士BRUKER公司）；采用5mm核磁管，TMS为内标，化学位移以ppm表示，吸收峰的多重性以 s，d，t，q，b 分别表示单峰、双峰、三重峰、多重峰和宽峰。

（3）IR谱：PERKIN-ELMER-983型傅立叶变换红外仪（日本岛津）；摄谱范围4000-450 cm-1，分辨率4 cm-1，KBr压片。吸收峰位置以cm-1为单位，强度以vs，s，m，w分别表示非常强、强、中强和弱。

（4）元素分析：VARI-EL型元素分析仪（德国EA元素分析系统公司），测定C、H、N。

（5）质谱测定：Themofinnigan Polaris质谱仪。

N-甲基咪唑购自于美国Sigma-Aldrich公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。

2.2 合成路线

合成路线如图1所示。

图1 化合物N 1，N 5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺的合成路线Fig.1 Thesynthetic routeofthe compound N1，N5-bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine.（i）DMF，100 ℃；（ii）anhydrousethylether；（iii）DMF，0℃.

2.3 实验步骤

2.3.1 三氯乙酰氯的合成

三氯乙酰氯按照文献[15]合成。将 300 g（1.8mol）三氯乙酸、10mlDMF和135ml（1.85 mol）二氯亚砜混合，加热回流2小时。蒸馏除去二氯亚砜，收集116～117.5℃的馏分。得到321.9 g产品（淡黄色透明液体）。产率96.4%。b.p.116～117.5℃。

2.3.2 N-甲基-2-三氯乙酰基咪唑的合成

在搅拌下将N-甲基咪唑（4.103 g，0.05 mol）的无水乙醚溶液在2小时内滴加入到三氯乙酰氯（9.09 g，0.05 mol）的无水乙醚溶液中，继续搅拌2小时。将4 g碳酸钾溶于15ml水中的溶液滴加到反应混合物中终止反应。分液后将醚层旋转蒸发，得到10.52 g产品（淡黄色固体）。产率93.1%。m.p.95-96 ℃；1H NMR （CDCl3）：7.48（d，J=1.7 Hz，1H），6.98（d，J=1.7 Hz，1H），3.67（s，3H）。13CNMR（CDCl3）：187.6，153.8，135.7，123.5，94.0，29.8。

2.3.3 N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺的合成

将化合物N-甲基-2-三氯乙酰基咪唑（1.8035 g，7.93 mmol）溶于 50 mLDMF，冰水冷却下搅拌20 min，将溶于10 mLDMF的二乙基三胺（0.4083 g，3.97 mmol）溶液滴加到上述溶液中，立即有黄色沉淀生成。冰水冷却下继续搅拌2 h，温度升至室温再搅拌2 h，停止反应。将反应混合液过滤，固体用THF、无水乙醚洗涤，真空干燥，所得固体再用热THF重结晶，得黄色固体。m.p.152.4-153.2℃。Anal.Calc.for C14H21N7O2：C，52.65；N，30.70;H，6.63。Found:C，52.62；N，30.68；H，6.65。1H NMR（300MHz，DMSO-d6δ，ppm）：8.02（t，J=1.65Hz，2H，H6），7.64（d，J=5.76Hz，2H，H3），7.18（d，J=1.92Hz，2H，H4），3.65（s，6H，H1），3.12（t，J=6.32Hz，4H，H7），2.85（m，J=7.08Hz，4H，H8），2.09 （s，1H，H9）。13CNMR （300MHz，DMSO-d6，δ，ppm），C5 158.2，C2 154.8，C3 137.1，C4 124.4，C8 48.6，C7 39.6，C1 29.1。IR （KBr）: ν（N-H）3419.6，ν（N-H）3249.8，ν（Im C-H）3105.2，ν（C-H）2985.6，ν（C-H）2904.6，ν（C=O）1587.3，ν （N-H）1562.2，ν （C=C）1490.9，ν（N-CH3 N-C）1469.7，ν（C-N）1338.5，ν（C-N）1311.5，ν （C-N）1223.6，ν （C-N）1130.2，ν（C-C）1064.9，ν（C-C）1014.5，ν（C-H）972.1，ν（C-H）896.8，ν（C-H）867.9，ν（Im C-H）781.1。HRMS:calculated forC14H21N7O2319.18；found 319.16。

3 结果与讨论

在合成过程中，考虑到二乙基三胺的结构对称性，我们选择了在其两端连接咪唑环的方案，合成了一种对称平行的多胺分子N1，N5-二（1-甲基咪唑-2-酰基）二乙基三胺。整个合成过程所采取的方法简便易行，不需过柱分离，每步合成都有较高产率。在此化合物基础上，还可继续连接其它不同的DNA识别基团，从而可合成一系列DNA定位切割剂，对DNA的不同位点进行定位切割。

在制备1-甲基-2-三氯乙酰基咪唑的过程中，发现此固体在空气中不稳定，很容易吸水潮解。因此，得到的固体应在真空干燥器中放入干燥剂真空保存，或者得到该固体后立即进行下一步的反应。

正常N-甲基咪唑环上的H3和H4在H1-NMR谱中的化学位移应在7.00和6.88左右，但在目标化合物中咪唑环上连有吸电基团HN-CO-，通过共轭效应和诱导效应使得其质子周围的电子云密度降低，对外加磁场的屏蔽效应减弱，所以其化学位移向低场移动，实际测得为7.64和7.18。而咪唑环上N-CH3上的质子（H1），由于与吸电基团HN-CO-相距较远，则受其影响不大。

标题化合物与DNA的作用及其生物功能，尚待进一步研究。

［1］Sigman，D.S.；Chen，C.B.，Chemical nucleases:new reagents in.molecular biology.Ann.Rev.Biochem.1990，59：207-236.

［2］Sigman，D.S.，Mazumder，A.，Perrin，D.M.，Chemical nucleases，Chem.Rev.1993，93（6）:2295-2316.

［3］Lown，J.W.，Novel linked antiviraland antitumor agents related to netropsin and distamycin，Organic Preparationsand Procedures Int.1989，21（1）：1-46.

［4］Finlay，A.C.，Hochtein，F.A.，Murphy，F.X.，Netropsin，a New Antibiotic Produced by a Streptomyces，J.Am.Chem.Soc.1951，73（1）：341-343.

［5］Kopak，M.L，Yoon，C.，Goodsell，D，Pjura，P.，Dickerson，R.E.，The Molecular Origin of DNA-Drug Specificity in Netropsin and Distamycin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1985，82（5）：1376-1380.

［6］Meir， B.， Boris， Y.， Raphael， M.， A total synthesis of distamycin a，an antiviral antibiotic，Tetrahedron 1978，34（15）：2389-2391.

［7］Guelev，V.M.，Harting，M.T.，Lokey，R.S.，Iverson B.L.，Altered sequence specificity identified from a library of DNA-binding small molecules，Chemistry&Biology 2000，7（1）：1-8.

［8］Wurtz，N.R.，Dervan，P.B.，Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole-imidazole polyamide conjugates， Chemistry& Biology，2000，7（3）：153-161.

［9］Ansari，A.Z.，Mapp，A.K.，Nguyen，D.H.，Dervan，P.B.，Ptashne M.，Towards a minimal motif for arti?cial transcriptional activators，Chemistry&Biology，2001，8（6）：583-592.

［10］Cho，J，Parks，M.E.，Dervan，P.B.，Cyclic Polyamides for Recognition in the Minor Groove of DNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92（22）：10389-10392.

［11］Walker，W.L.，Landaw，E.M.，Dickerson，R.E，Goodsell，D.S.，Estimation of the DNA sequence discriminatory ability of hairpin-linked lexitropsins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94（11）：5634-5639.

［12］Baird，E.E，Dervan，P.B.，Solid Phase Synthesis of Polyamides Containing Imidazole and Pyrrole Amino Acids，J.Am.Chem.Soc.1996，118（26）：6141-6146.

［13］Xiao，J.H.，Yuan，G.，Huang，W.Q.，Tang，F.L.，Chan，A.S.C.，Lee，K.L.D.，Synthesis of Pyrrole-Imidazole Polyamide， Chinese Chemical Letter，2000，11（3）：207-208.

［14］Yang P.，Ren R.，Guo M.L.，Song A.X.，Double-strand hydrolysis of DNA by a magnesium（Ⅱ）complexwith diethylenetriamine.J.Biol.Inorg.Chem.2004，（9）：495-506.

［15］周成勇，朱苗力，杨频.二［1- 甲基 -4-（1- 甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基）吡咯-2-酰胺基乙基］胺的合成与表征，有机化学，2006，26（6）：831-834.

Synthesis and Characterization of N1,N5-Bis（1-methylim idazole-2-carbonyl）Diethylenetriam ine

ZHOU Cheng-Yong，ZHANG Bao-xiu
（Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi Shanxi 046011）

In this paper,the synthesis of a sort of symmetrical and parallel polyamide，N1，N5-Bis（1-methylimidazole-2-carbonyl）diethylenetriamine，was reported first.The whole process was also simple and convenientwithout column chromatography with high yields.The target compound was anticipated to recognize DNA sequence specifically and cleave itat predetermined site.

imidazole；diethylenetriamine；polyamide；chemical nuclease

O62

A

1673-2014（2011）02-0001-04

2010—10—18

山西省高校科技开发项目资助课题（№：2007154）

周成勇（1963— ），男，河南省沁阳市人，博士，教授，主要从事有机合成和生物无机化学方面的研究。

（责任编辑 王璟琳）