氟苯尼考琥珀酸钠抗菌活性研究

秦光成，李逐波，张聪，刘畅，杨鹏，陈力学*

(1.重庆医科大学附属第一医院实验研究中心，重庆400016;2.西南大学药学院，重庆400716;3.第三军医大学动物中心，重庆400038)

氟苯尼考(florfenicol，F)是第三代氯霉素类广谱抗生素，但由于水溶性较差，约为1.3 mg/mL，在临床上的使用受到了一定的限制。经过前期研究得到氟苯尼考的一种水溶性前药氟苯尼考琥珀酸酯(florfenicol succinic，Fs)，其钠盐氟苯尼考琥珀酸钠(florfenicol Sodium succinic，Fs-Na)在水溶液中的溶解度可达500 mg/mL，合成工艺简单，成本低廉，收率稳定，适于工业化大生产［1］。氟苯尼考琥珀酸钠为氯霉素类广谱抗生素，是一种白色或类白色的结晶性粉末，分子式为C16H17Cl2NSO7FNa，分子量为481.22，化学命名为2，2-二氯-N-(1-(氟甲基)-2-羟-2-〔4-(甲基磺酰)苯基〕乙基)乙酰胺琥珀酸钠，化学结构式如图1。氟苯尼考琥珀酸钠是根据前药原理设计合成的。杨鹏等通过体外抑菌实验的最低抑菌浓度(MIC)对前药(氟苯尼考琥珀酸酯、钠)与氟苯尼考(母药)抗菌活性进行了对比考察，研究表明氟苯尼考经修饰前后体外的MIC有显著的差异。但后期通过对氟苯尼考的药代动力学研究发现，前药氟苯尼考琥珀酸钠在动物体内能够迅速转化为母药［2］。为了进一步验证其在体内转化后的抗菌效果，本文采用微生物法来评价和考察氟苯尼考修饰前后在大鼠体内转化后的抗菌活性，为临床前的药效学实验提供了一定的理论依据。

图1 氟苯尼考琥珀酸钠的结构式Fig.1 The structural of florfennicol sodium succinate

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级Wistar大鼠4只，雌雄各半，平均体重(200±20)g，购于重庆医科大学实验动物中心。实验前于动物房适应性饲养1周，给药前停食1 d。

1.1.2 实验药品牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠等均为分析纯;培养皿、牛津杯洗净后灭菌备用;氟苯尼考99.6%，购于浙江台州海翔医药化工有限公司;氟苯尼考琥珀酸酯99.7%，西南大学药学实验平台有机合成实验室合成。

1.1.3 菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、枯草芽胞杆菌(ATCC 6633)、变形杆菌(ATCC 6896)由西南大学药学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 体内抑菌实验方法的建立体内抑菌试验采用微生物法［3-6］，实验动物采用大鼠，按30.0 mg/kg分别肌注氟苯尼考及其前药(按氟苯尼考30.0 mg/kg载药量给药)。药后按不同时间段从大鼠尾静脉采血0.5 mL，置于经肝素钠抗凝处理的1.5 mL离心管中，3 000 r/min离心15 min后，分离血浆备用进行抑菌试验，通过抑菌圈直径的大小来对前药氟苯尼考琥珀酸钠与母药氟苯尼考进行对比研究，考察前药经过体内酶转化成氟苯尼考后的抑菌效果，并根据母药的标准曲线可以推测不同时间段大鼠体内氟苯尼考血药浓度。标准曲线的制备:取氟苯尼考用pH 7.0磷酸盐缓冲液配制，与空白血浆依次配制浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL的7种加标血浆。分别取加标血清100 μL加到制备同一碟中的4只牛津杯中，平行做3只培养皿。按条件培养后测量抑菌圈直径，算各浓度加标血浆抑菌圈直径的均值(φ)，以各加标血清浓度(C)对数与相应的菌圈直径作线性拟合，得到φ-lgC方程在16～0.25 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，其回归方程分别为:大肠埃希菌φ=11.105lgC+15.486(R2=0.990 2);金黄色葡萄球菌φ=14.522lgC+13.943(R2=0.996 8);枯草芽胞杆菌φ=14.04 7lgC+15.486(R2=0.998 7);变形杆菌φ=13.288lgC+14.333(R2=0.995 3)。

图2 氟苯尼考对大肠埃希菌抑菌效果标准曲线Fig.2 The standard curves of restrain effect of FF to EC

图3 氟苯尼考对变形杆菌抑菌效果标准曲线Fig.3 The standard curves of restrain effect of FF to PV

图4 氟苯尼考对枯草芽胞杆菌抑菌效果标准曲线Fig.4 The standard curves of restrain effect of FF to BS

图5 氟苯尼考对金黄色葡萄球菌抑菌效果标准曲线Fig.5 The standard curves of restrain effect of FF to SA

1.2.2 方法回收率与精密度按照标准曲线制备项下的方法制备浓度分别为16、8、0.8 μg/mL高、中、低3种浓度的加标血浆，按照供试样测定方法测定，每种样品平行测定3次和在不同日期测定3次，计算它们的日内与日间精密度，并代入标准曲线计算各样品的回收率。

表1 方法回收率与精密度Table 1 Method precision and recovery

方法相对回收率与精密度见表1。由表1可知，高、中、低3种药物浓度的相对回收率在99%～106%之间，RSD＜10%。

1.2.3 生物样的测定将配好的普通肉汤琼脂培养基及平皿高压灭菌，当温度降至50℃左右时，取20 mL于平皿中制成平面，4℃保存。分别用肉汤将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、枯草芽胞杆菌稀释为标准菌液备用。用高压灭菌的棉棒分别将菌液均匀涂布于平板上，平皿琼脂上放置牛津杯。然后在给药后0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h采血按“1.2.1”血浆处理方法处理分离血浆，取血浆100 μL加入到牛津杯中，置37℃培养箱内培养18～24 h，观察抑菌圈大小。

1.2.4 统计学分析采用SPSS 12.0统计软件，对两独立样本的t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸钠对4种不同敏感菌抑菌效果对比

氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸钠对4种不同敏感菌抑菌效果对比见图6、7、8及图9。

图6 F及Fs-Na对枯草芽胞杆菌的体内抑菌效果对比图Fig.6 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against BS

图7 F及Fs-Na对大肠埃希菌的体内抑菌效果对比图Fig.7 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against EC(mm)

图8 F及Fs-Na对变形杆菌的体内抑菌效果对比图Fig.8 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against PV

图9 F及Fs-Na对金黄色葡萄球菌的体内抑菌效果对比图Fig.9 An in vivo inhibition zone of F and Fs-Na against SA(mm)

2.2 氟苯尼考琥珀酸钠在大鼠体内不同时间点转化情况

表2 氟苯尼考与氟苯尼考琥珀酸钠体内抗菌效果对比研究Table 2 In vivo antibacterial activity of F and Fs-Na expressed as inhibition zone(mm)

氟苯尼考与氟苯尼考琥珀酸钠的抗菌效果对比情况见表2。由表2可以看出，氟苯尼考及氟苯尼考琥珀酸钠经动物体转化后，从0～3 h这段时间内，抑菌圈直径(mm)以及血药浓度C*是相当的，故其抗菌效果是相当的，但前药较母药在给药4 h后抗菌能力有一定的下降，但统计学分析表明P＞0.05差异不显著，同时给药12 h后两者几乎都没有抗菌活性。并根据标准曲线，可以初步推算出血浆中氟苯尼考的血药浓度，给药1 h后可以达到最大血药浓度(4.0 μg/mL)。

3 讨论

杨鹏等［7］通过体外抑菌实验的最低抑菌浓度(MIC)对前药(氟苯尼考琥珀酸酯、钠)与氟苯尼考抗菌活性进行了对比考察，研究表明氟苯尼考经修饰前后体外的MIC有显著的差异，其中研究结果还表明对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌敏感度降低了64倍，对变形杆菌、大肠埃希菌降低了128倍。因此根据前药原理可以得知母药成功潜伏化，符合前药设计要求［8］。

从表2可以看出，前药与母药从给药后0～3 h这段时间内其抑菌圈直径以及血药浓度C*是相当的，且在1～1.5 h能达到最大血药浓度为4.0 μg/mL，说明前药和母药对4种细菌都有良好的抗菌活性，且效果相当。这恰好验证了前药在体外活性较低或者无活性，注射到动物体内后，在体内各种酶的作用下能够迅速转化为母药氟苯尼考发挥其抗菌活性的前药原理。因此说明氟苯尼考琥珀酸钠作一种前药在大鼠体内能迅速转化为氟苯尼考母药而发挥其抗菌活性，这与通过HPLC对氟苯尼考琥珀酸钠的药代动力学研究的结果是一致的［2］。通过对氯霉素类抗生素基本骨架构效关系分析，要期望用化学方法通过化学结构修饰引入小分子载体来提高其水溶性而不改变其生物活性，研究证实要达到此目的，只能在氟苯尼考分子结构的苄仲羟基位置进行结构修饰，同时也证明了苄仲羟基为氟苯尼考发挥抗菌作用的一活性基团。

但前药较母药在给药4 h后抗菌能力有一定的下降，血药浓度也有一定差异，可能是由于前药在转化的同时一部分也在代谢，但统计学分析表明差异并不显著(P＞0.05)。动力学研究表明［2］，最大血药浓度可以达到6.28 μg/mL，且在给药72 h后还能检测到血浆中氟苯尼考浓度为0.17 μg/mL，与本文研究的最大血药浓度为4.0 μg/mL和给药后12 h不能够检测到氟苯尼考有一定差异，这种差异可能是因为药物与血浆蛋白结合不能良好的发挥其抗菌活性，影响了抑菌圈的大小。同时这也可能是由于实验动物的个体差异以及给药的季节差异等诸多方面因素影响造成的。且前期对氟苯尼考琥珀酸钠的局部毒性试验考察表明，在其临床的使用剂量内是安全的［9］。所以通过化学结构修饰得到的氟苯尼考琥珀酸钠在不改变其药理活性的情况下，从根本上解决了氟苯尼考水溶性低，使用有机溶剂做助溶剂使得局部连续给药刺激性大的难题，为氟苯尼考在临床上进一步的广泛推广奠定了良好的基础，然而其在靶动物的有效性还有待于进一步研究。

［1］ 秦光成，陈力学，李逐波.氟苯尼考琥珀酸单酯的合成工艺优化［J］.合成化学，2010，18(1):121-123.

［2］ 秦光成，陈力学，李逐波.氟苯尼考琥珀酸钠在大鼠体内的药代动力学研究［J］.西南大学学报(自然科学版)，2010，32(7):161-166.

［3］ 唐欣，钱平利，温泉，等.微生物法测定阿齐霉素的血药浓度［J］.武警医学，2004，15(11):806-807.

［4］ 颜喜亚.微生物法测定青霉素残留量的研究［J］.河北省科学院学报，2006，23(2):84-86.

［5］ 陈淑云，沈琴华，王勇.微生物法测定环丙沙星片在人体中的药物动力学和生物利用度［J］.中国医院药学杂志，1993，13(9):389-390.

［6］ 简洁.微生物测定阿米卡星血药浓度［J］.桂林医学院学报，1996，102:203-204.

［7］ 杨鹏.氟苯尼考琥珀酸钠的合成与药理作用初探［D］.西南大学硕士学位论文，2008.

［8］ Valentino J Stella，Kenneth J Himmelsteisn.Prodrug and sitespecific drug delivery［J］.J Med Chem，1980，23(12):1275-1282.

［9］ 秦光成，李逐波.氟苯尼考水溶性前药局部毒性研究［J］.兽药与饲料添加剂，2009，14(2):1-4.