微生物絮凝剂产生菌固定化条件的优化

王兰，赵璇

(南开大学环境科学与工程学院，天津300071)

微生物絮凝剂是利用生物技术，从微生物或其分泌物中分离、提取得到的新型高分子絮凝剂，具有可生物降解、高效安全、无毒和无二次污染等优点，因而近年来倍受各国水处理工作者的重视［1-5］。但絮凝剂用量大、成本高等问题给微生物絮凝剂在工业上广泛应用造成了巨大障碍［3-9］。固定化微生物技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等行业广泛应用，效果显著［10-12］。它是利用物理或化学的手段将游离微生物细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法。固定化微生物技术与传统的悬浮生物处理法相比，具有效率高、反应易控制、微生物的高效高密度、固液分离效果好、对环境的耐受力强等优点［13-14］。利用固定化微生物技术可以提高菌体利用率，提高产量［14］，鉴于此，本文对微生物絮凝剂产生菌的固定化方法及固定化条件进行研究，比较了利用固定化菌和游离菌所产絮凝剂的絮凝效果，并对生产和使用过程中该絮凝剂的稳定性进行探讨，旨在为降低生产成本，提高生产效率，以便将来应用于废水生物处理中，取代传统的化学絮凝剂，为工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种微生物絮凝剂产生菌M09，本实验室筛选，经鉴定为酱油曲霉(Aspergillus sojae)，斜面保存。

1.1.2 固定化载体材料多孔聚氨酯泡沫、秸秆芯儿、玉米棒芯儿、棉线与多孔吸附树脂(SH-1，RD和NR)

1.1.3 培养基(质量分数，%)NaNO30.3，KCl 0.05，K2HPO40.1，FeSO40.001，MgSO4·7H2O 0.05，蔗糖3，pH 5.0～5.5;以上培养基加入琼脂2%即为固体培养基。培养基采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种M09的液体培养方法250 mL三角瓶中装入75 mL培养基，灭菌冷却后，接入斜面菌种，29℃150 r/min振荡培养72 h所得发酵液即为高絮凝活性的微生物絮凝剂。

1.2.2 菌种M09的固定化方法①表面吸附法:将事先经过预处理的固定化载体，按照一定的固液比投入1.1.3培养基中共同灭菌，冷却后接入M09孢子悬液，于28℃恒温振荡培养60 h后，菌体即吸附于载体表面，得到固定化菌体;②海藻酸钠包埋法:将一定浓度的菌悬液和2%海藻酸钠溶液混合，用注射器缓慢匀速地滴入浓度为1%CaCl2溶液中，形成直径为2～3 mm的固定化小球，滴完后于28℃固定4 h，再将小球用无菌水洗涤2～3次，最后放入浓度为1%戊二醛溶液中于4℃硬化24 h［12］。

1.2.3 微生物细胞固定化条件的优化固定化条件包括载体颗粒大小(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm与1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，固定化载体重量与培养基体积之比(固液比)(3、4、5与6 g/L)，固定化培养基的碳源(果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉)，培养基初始蔗糖浓度(1%、2%、3%)及培养基碳氮比(蔗糖∶NaNO3)(3∶1(2%∶0.67%)、5∶1(2%∶0.4%)、10∶1(2%∶0.2%))。

1.2.4 微生物絮凝率的测定方法用量筒量取高岭土悬浮液(4 g/L)60 mL置100 mL烧杯中，加入0.4 mL测试发酵液，在四联电动搅拌器上进行搅拌，快速搅拌(400 r/min)1 min，慢速搅拌(50 r/min)5 min，然后静置5 min，取上清液用分光光度计在550 nm处测定其吸光度。用蒸馏水代替发酵液作为空白对照，样液做3个平行。絮凝活性用絮凝率来表征，其计算方法如下:

式中:Ⅰ为絮凝率;A为待测样品的OD550nm值;B为对照组的OD550nm值。

1.2.5 发酵液中残留蔗糖的测定蔗糖的测定采用盐酸水解法，使蔗糖水解成还原糖后用斐林试剂法测定水解得到的还原糖含量［15］。

2 结果与分析

2.1 不同固定化方法对M09产絮凝剂的影响

按照1.2.2方法对菌M09进行固定化，将固定化的菌以一定的固液比加入到1.1.3培养基中，28℃150 r/min振荡培养，在不同时间点取发酵液测得絮凝率见图1。

图1 不同固定化方法对M09菌产絮凝剂的影响Fig.1 Effect of immobilized ways on bioflocculant production of M09

由图1可知，采用吸附法所得固定化细胞发酵上清液的絮凝效果要好于采用包埋法固定化细胞。这可能是因为包埋法的微生物细胞被包埋在载体内部，影响了传质效果，进而影响了微生物的活性［11-13］;或是较高的CaCl2产生了高渗透压作用，引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失［14］;或是交联时间的原因，因为交联时间越长，所得固定化凝胶小球的强度越高，内部结构更为紧密，不利于基质的传递，从而使细胞失活率增大［13］。因此以下实验皆选用表面吸附法做为菌M09的固定化方法。

2.2 不同固定化载体对微生物产絮凝剂的影响

选用的固定化载体有多孔聚氨酯泡沫、秸秆芯、玉米棒芯、棉线与大孔吸附树脂(SH-1、RD和NR)。将各固定化载体投加到含有100 mL固定化培养基的250 mL的锥形瓶中，121℃20 min灭菌后，接入M09菌，28℃150 r/min固定化培养60 h后，测定各发酵上清液的絮凝率如表1。

表1 不同固定化载体对微生物产絮凝剂絮凝活性的影响Table 1 Effect of immobilized carrier on bioflocculant production

由表1可知，以多孔聚氨酯泡沫做为固定化载体的发酵上清液絮凝活性最高，絮凝率达到91.45%;其次是大孔吸附树脂RD、SD-1与玉米棒芯，絮凝率分别为89.55%、88.45%与80.79%。试验过程中发现，以大孔吸附树脂为载体的固定化效果较差，绝大部分的M09菌游离在发酵上清液中;玉米棒芯处理的发酵上清液浑浊不清，因此选择采用多孔聚氨酯泡沫做为M09菌的固定化载体。

2.3 菌M09固定化条件的优化

2.3.1 载体颗粒粒径对菌M09固定化及絮凝效果的影响试验选用2种多孔聚氨酯泡沫颗粒粒径(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm与1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm)，采用表面吸附法进行菌M09固定化培养，得到固定化菌体细胞并加入灭菌后的培养基，于28℃、150 r/min振荡培养，其后每隔12 h

测定絮凝率并更换一次发酵培养基，计作1批，试验持续了72 h，共6批，每批次做3个重复，平均后得结果见图2。图2表明，在发酵最初2批次，2处理的絮凝效果均较好，絮凝率均在86%以上。随着发酵批次的增加，载体颗粒粒径小的处理发酵上清液絮凝效果明显好于载体粒径大的发酵上清液絮凝效果，且这种差异随批次增加逐渐呈增大趋势;观察菌体的固定化情况发现，培养最初，尚有部分菌丝游离分散在培养液中，大约发酵3个批次后，菌丝体几乎全部吸附在载体上，载体上固定菌丝由最初的半透明状变为白色，而载体颗粒粒径较大的处理培养基中有游离的菌丝体，这可能是由于单位重量载体粒径越大，其总的表面积越小，可用于固定化菌吸附的空间越小，以致那些没有固定上的菌体随着培养基的更换而流失减少了，最终影响了絮凝剂的产量，此现象随着发酵批次的增加愈加明显。因此以下试验则选用固定化载体颗粒粒径为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。

图2 载体颗粒粒径对菌M09产生絮凝剂絮凝效果的影响Fig.2 Effect of immobilized carrier size on bioflocculant production

2.3.2 固液比对菌M09固定化及絮凝效果的影响试验选用3、4、5与6 g/L 4种固液比，接入菌M09，置于28℃、150 r/min下振荡培养60 h，将所得固定化菌体加入灭菌后的发酵培养基，于28℃、150 r/min振荡培养，其后每隔12 h测定絮凝率并更换一次发酵培养基，计作1批，试验持续72 h，共6批，每批次做3个重复，平均后的结果见图3。由图3可知，在发酵最初3批次，各处理的絮凝效果均较好，絮凝率均在89%以上。随着发酵批次的增加，固液比为4 g/L和5 g/L的发酵上清液絮凝效果明显好于其他处理的发酵上清液絮凝效果。观察菌体的固定化情况发现，培养至第4批时，3 g/L处理的发酵上清液中出现了悬浮的菌丝体，这可能是导致絮凝剂产量减少，絮凝率下降的原因;而6 g/L处理的发酵上清液絮凝率减小，可能是因为培养基中的营养不能满足载体上不断增多的菌丝体合成絮凝剂的需要，而导致部分菌体死亡，进而使絮凝剂产量减少，絮凝效果下降。因此考虑到经济及效果等原因，以下试验均采用4 g/L固液比。

图3 固液比对菌M09产絮凝剂絮凝效果的影响Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on bioflocculant production

2.3.3 不同碳源对菌M09固定化及絮凝效果的影响采用1.1.3中的培养基，只改变其中的碳源种类，灭菌后接种菌M09，置于28℃、150 r/min的振荡培养箱中培养，固定化培养60 h后分别测各培养液的絮凝率，结果见表2。

表2 不同碳源对絮凝剂产生的影响Table 2 Effect of different carbon source on bioflocculant production

由表2可知，采用蔗糖作为碳源的培养基所得培养液絮凝效果最好，絮凝率达到87.2%;其余各处理培养液絮凝率均在80%以下，其中以可溶性淀粉作为碳源的培养基所得培养液絮凝率最小，为12.3%，这可能是由于菌M09摄取碳的生理途径、碳源进入细胞的方式及数量多少的不同而引起的［16-18］。因此，以下实验选用的培养基碳源为蔗糖。

2.3.4 初始蔗糖浓度对菌固定化及絮凝效果的影响将M09菌接入初始蔗糖浓度为1%、2%与3%的培养基中，置于28℃，150 r/min的摇床中培养，分别考察培养时间为24、36、48、60、72、84、96 h的发酵上清液的絮凝率(a)与残糖(蔗糖)量(b)。结果见图4。

图4 初始蔗糖浓度对产絮凝剂絮凝效果的影响Fig.4 Effect of initial sugar concentration on bioflocculant production

从图4中看出，利用蔗糖浓度为1%的培养基固定化培养M09菌48 h后，上清液絮凝活性最高，絮凝率达到78.51%，继续培养至96 h，絮凝活性呈下降趋势。利用蔗糖浓度2%与3%的固定化培养基，在最初培养的24 h内，2处理絮凝率差别不大，继续培养至60 h，前者的絮凝率明显优于后者，且2处理在培养60 h时絮凝率达到最大，分别是89.10%和83.45%;而此时2处理发酵上清液中残糖分别为0.91%和1.56%，由此可明显看出，利用3%蔗糖浓度，其发酵上清液中残糖浓度过高，造成了浪费，故在以后的试验中即采用2%作为培养基的初始蔗糖浓度。

2.3.5 培养基碳氮比对菌固定化及絮凝效果的影响为了确定最优的培养基碳氮比，实验分别以碳氮比(蔗糖:NaNO3)为3∶1(2%∶0.67%)、5∶1(2 %∶0.4%)、10∶1(2%∶0.2%)的培养基对M09菌进行振荡培养，并在培养至36、48、60、72 h取样测定培养液絮凝率，结果见表3。由表3可以看出，随着碳氮比的增大，培养液絮凝率呈现逐渐下降的趋势，碳氮比为3∶1培养液絮凝效果最好，在培养72h后培养液絮凝率可达91.3%，而碳氮比为5∶1、10∶1分别为90.2%、89.6%。考虑到碳氮比为5∶1在培养至48 h培养液絮凝率已近90%，综合考虑成本，选择培养基的碳氮比为5∶1。

表3 培养基碳氮比对絮凝剂产生的影响Table 3 Effect of different C/N ratio of culture medium on bioflocculant production

2.4 利用优化条件进行M09菌的固定化试验

采用以上优化的固定化条件(利用粒径为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的聚氨酯泡沫为固定化载体，4 g/L的固液比，使用初始蔗糖浓度为2%，NaNO3为0.4%的培养基，28℃振荡培养)对M09菌进行固定化，可以观察到，在固定化培养初期，部分菌丝游离分散在培养液中，培养约30 h后菌丝部分附着在载体上，载体由最初的黑色变为白色。培养至60 h，培养液透亮，呈淡绿色，而菌丝则完全附着在载体上，载体的吸附效率相当高，这可能是因为载体表面比较粗糙，易于被菌丝吸附，不易脱离。可见，用此方法对菌M09进行固定化是可行的，固定了菌M09前后的载体见图5。

图5 固定菌M09前后的载体Fig.5 Contrast between the original carrier and the carrier of immobilized M09

2.5 利用游离菌与固定化菌所产絮凝剂絮凝效果的比较

分别利用固定化菌和游离菌进行发酵实验，所得发酵液絮凝效果比较见图6。由图6可以看出，固定化菌培养2 h后即可获得絮凝活性较高的发酵上清液，其絮凝率达70.3%，继续培养至8 h，絮凝率达到86.9%;而游离菌的发酵上清液絮凝效果较差，4 h絮凝率仅达24.0%，继续培养至8 h，絮凝率才有较明显的上升，培养至12 h时絮凝率达到78.7%。由此说明在同样的接种量及相同培养条件下，固定化菌的发酵上清液絮凝活性大大高于游离菌发酵上清液的絮凝活性，所以采用固定化菌生产微生物絮凝剂具有明显的优势。

图6 游离菌与固定化菌产絮凝剂絮凝效果的比较Fig.6 Comparison of flocculating activity of free and immobilized M09

2.6 不同存储条件对具有高絮凝活性发酵液絮凝活性的影响

具有高絮凝活性的发酵液在生产或使用过程中，常常会遇到不能及时处理或使用，需存放一段时间的情况，那么，研究不同存储条件对其絮凝活性的影响就显得尤为重要。不同存储条件下发酵液的絮凝活性变化见图7。由图7可以看出，不同存储条件下发酵液的絮凝活性差别很大，其中在室温(25℃左右)保存下，发酵上清液(不含菌体)的絮凝率下降最快，3 d后的絮凝率降低至12.2%，几乎没有絮凝效果;而含有菌体的发酵液的絮凝率没有下降，一直维持在90%以上，这可能是因为在此条件下菌体还能不断产生絮凝剂，从而在一定程度上弥补了絮凝活性的下降。在4℃下保存的各处理絮凝率也有一定程度的下降。因此，利用固定化菌生产絮凝剂后期，所产高絮凝活性发酵液若不能及时处理或使用可将其存放在反应器中，停止通气，防止杂菌污染，发酵液絮凝率仍可缓慢持续上升，维持较高水平达数日，具有高度的稳定性。

图7 不同存储条件对发酵液絮凝活性稳定性的影响Fig.7 Effect of condition of storage on flocculating activity

3 结论

对微生物固定化方法与固定化载体进行选择，研究表明吸附法是固定M09菌的最佳方法，多孔聚氨酯泡沫是固定化菌的良好载体，具有经济、高效的特点。

通过单因子实验对絮凝剂产生菌M09固定化条件进行优化，综合考虑絮凝效果和经济成本，最终所得优化的固定化条件:选用粒径为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的多孔聚氨酯泡沫为固定化载体，4 g/L的固液比，使用初始蔗糖浓度为2%，NaNO3为0.4%的培养基，28℃振荡培养，菌体可在较短时间内全部吸附在载体上，可获得较高活性的固定化细胞，发酵上清液能够保持较高的絮凝活性，絮凝效果最好。研究还发现，固定化菌的发酵上清液絮凝活性大大高于游离菌的发酵上清液，所以采用固定化菌体生产微生物絮凝剂具有明显的优势。

具有高絮凝活性的发酵液在不同存储条件的絮凝活性稳定性不同，其中在室温保存下，含有菌体的发酵液在静止条件下絮凝活性可保持数日，这可能是因为在此条件下菌体能不断产生絮凝剂，从而在一定程度上弥补了絮凝活性的下降。因此，利用固定化菌生产絮凝剂后期，所产生高活性发酵液若不能及时处理或使用可将其存放在反应器中，自然静置，防止杂菌污染，在室温下保存数天，仍可维持较高的絮凝活性，具有高度的稳定性，不需要特殊的保存条件与手段，这样可降低工艺成本，节约设备运营能源，既提高了效率，也为其工业化生产和应用提供了便利。

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