不同毒力疟原虫感染早期根治性治疗对免疫记忆形成影响的研究

刘英杰，李莹，潘艳艳，朱晓彤，刘军，单风平，曹雅明*

(1.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁沈阳110001)

疟疾流行的显著特征是反复感染普遍存在。目前全球流行的疟疾主要由恶性疟原虫和间日疟原虫感染所致，其中前者毒力较强，并且再感染的发生风险也明显高于后者［1］。持久性免疫记忆的建立可抵御再感染的发生或可减少再感染后的虫荷水平［2］。间日疟感染者痊愈后，其免疫记忆水平可恒定保持数月［3］，并可对间日疟原虫抗原产生明显的应答反应，但恶性疟感染者却未能产生此应答反应［4］。这表明毒力不同虫株感染与免疫记忆形成以及再感染的发生存在密切相关性。但恶性疟和间日疟感染早期根治性治疗后，其免疫记忆形成是否存在差异目前尚未见明确报道。致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL，P.y 17XL)和非致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XNL，P.y17XNL)分别与恶性疟原虫和间日疟原虫具有相似的生物学特性［5］。本研究对P.y17XL和P.y17XNL感染早期DBA/2小鼠进行根治性治疗，然后用同种疟原虫进行再感染，通过对再感染前后脾细胞中记忆性T、B细胞百分率检测，以期明确毒力不同虫株感染早期根治性治疗后的免疫记忆形成是否存在差异，并探讨再感染能否进一步促进免疫记忆的产生。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料6～8周龄雌性DBA/2小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所;P.y17XL和P.y17XNL由日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠。

1.1.2 主要试剂氯喹和青蒿琥脂片分别购自上海中西药业有限公司和广西桂林药业有限公司;细胞荧光标记抗体、HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a及底物均购自BD Pharmigen。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染和治疗及再感染小鼠经腹腔分别接种P.y17XL和P.y17XNL(1×106)寄生的红细胞，尾静脉采血，观察红细胞感染率。初次感染后3 d，开始经口给药(青蒿琥脂片60 mg/kg，氯喹90 mg/kg)，1次/d，连续3 d。初次感染后90 d，用同种疟原虫再次感染小鼠。

1.2.2 脾细胞中记忆性T、B细胞百分率的检测

无菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5天小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，调脾细胞终浓度为1×107/mL。在预先加入封闭抗体的染色管中加入脾细胞悬液0.1 mL，然后在检测记忆性T细胞染色管中依次加入FITC-conjugated anti-mouse CD4、APC-conjugated anti-mouse CD62L和PE-conjugated anti-mouse CD45RB;在检测记忆性B细胞染色管中加入PerCP-conjugated anti-mouse B220和FITC-conjugated anti-mouse IgG，洗涤2次，流式细胞仪检测。

1.2.3 统计学处理应用SPSS 11.5统计学分析软件，Student’s-t检验比较各组均值的显著性差异，P＜0.05为差异显著(结果为3次结果的均值)。

2 结果与分析

2.1 再感染后不同时间的原虫血症水平

如图1所示，感染早期根治性治疗的小鼠在再感染过程中仅出现了短暂的低水平虫体血症。在再感染后每一检测时间点，不同毒力虫株的虫体血症水平基本相似，并均于攻击后第6天左右自愈;而未治疗初次感染小鼠的虫体血症水平持续升高，表明毒力不同疟原虫初次感染早期根治性治疗的小鼠对同种疟原虫的再感染具有相似的抵抗力。

图1 P.y17XL和P.y17XNL初次感染和再感染后的虫体血症水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infectionand reinfection with P.y17XL and P.y17XNL

2.2 再感染前后不同时间点脾T细胞中记忆性T细胞的百分率

如图2所示，在再感染前，2种毒力不同虫株感染鼠脾T细胞中的记忆性T细胞百分率均略高于正常小鼠，与之相比，再感染后的记忆性T细胞百分率均明显增加(*P＜0.05或＊＊P＜0.01);与相应的再感染前小鼠相比，P.y17XL感染鼠的记忆性T细胞在再感染后第1天即出现了有意义的升高(☆P＜0.05)，而P.y17XNL感染鼠在再感染后第5天也出现了有意义的升高(☆P＜0.05)。这表明再感染前小鼠体内存在少量的记忆性T细胞;再感染可促进记忆性T细胞形成。但在每一相同检测时间点，不同毒力虫株感染鼠的记忆性T细胞水平基本相似。

图2 再感染前后不同时间点脾T细胞中记忆性T细胞的百分率Fig.2 The percentage of memory T cell in spleen T cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

2.3 再感染前后不同时间点脾细胞中记忆性B细胞的百分率

图3 再感染前后不同时间点脾细胞中记忆性B细胞的百分率Fig.3 The percentage of memory B cells in spleen cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

如图3所示，再感染前小鼠脾细胞中记忆性B细胞的百分率略高于正常鼠;与正常鼠或再感染前小鼠相比，感染后第3、5天，2组小鼠记忆性B细胞百分率均明显增加(＊＊P＜0.01;☆P＜0.05或☆☆P＜0.01);但在再感染后第5天出现不同程度的下降。在每一相同检测时间点，不同毒力虫株感染鼠的记忆性B细胞水平大致相同。表明再感染前小鼠体内存在少量的记忆性B细胞;再感染可促进记忆性B细胞的形成，但高水平记忆性B细胞不能持续存在。

3 讨论

有研究显示，间日疟感染者痊愈后，其免疫记忆可持续存在，并可对间日疟原虫抗原产生明显的应答反应，但恶性疟感染者却未能产生此应答反应［3-4］。提示毒力不同虫株感染与免疫记忆形成以及再感染的发生存在密切相关性。疟原虫感染虽然可诱导记忆性T、B细胞产生［6-8］，但强毒株疟原虫感染可抑制免疫记忆形成［9］。

本研究显示，在再感染过程中，2组小鼠均出现了短暂的低水平虫体血症。表明2组小鼠对同种疟原虫的再感染具有相似的抵抗力。再感染前，2组小鼠脾细胞中记忆性T、B细胞水平相似，均略高于正常小鼠，提示感染早期根治性治疗小鼠可产生少量免疫记忆T、B细胞。有实验证实，少量记忆性T、B细胞的存在，即使不能完全抵御再感染的发生，但也可明显降低再感染的虫荷水平［6-8］，与本研究结果基本吻合。此外，本研究还显示，再感染可进一步促进记忆性T、B细胞产生，但无论是再感染前或再感染后，2组小鼠记忆性T、B细胞的水平在相同检测时间点均没有显著差异。可见，当P.y17XL和P.y17XNL感染的红细胞在外周血出现时即进行根治性治疗，可使小鼠受到相同虫荷的抗原刺激，同时也阻止了P.y17XL对免疫记忆形成的抑制作用，因此2组小鼠获得了相似的免疫记忆和抵御再感染的能力。

综上所述，不同毒力疟原虫感染早期的根治性治疗可使宿主产生水平相近的免疫记忆，再感染可促进免疫记忆的形成，但再感染后第5天记忆性B细胞水平的明显下降，是否可以解释人类不能对疟疾感染产生消除性免疫尚有待进一步证实。

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