环境pH诱导出芽短梗霉细胞多形化

孔维甲，徐琼，靳建忠，王慧娟，李炳学

(沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110866)

环境pH值是影响微生物生长繁殖、生理代谢的重要因素，每种微生物都有特定的适宜生长的pH值范围和最适宜生长pH值。在自然条件下，微生物所处生态位的pH值经常处于动态变化过程中。对于直接和环境接触的单细胞微生物来说，适应环境pH值变化就显得尤其重要。某些酵母状真菌(如假丝酵母和白色念珠菌)在进化过程中，形成了酵母状细胞和菌丝之间相互转变的两形性细胞转变现象。这种细胞形态转变的现象也受到全局调控因子调控，在不同环境pH值表现出不同的细胞转变规律，形成更适合特定环境的细胞类型［1］。在环境pH不利于细胞生长繁殖时，酵母状细胞转变成假菌丝，寻找新的适宜环境;在遇到适宜生长pH值时，假菌丝可以出芽繁殖产生更多后代，有利于物种繁衍［2］。研究真菌细胞形态转变与适应环境酸碱度变化的关系具有重要的科学意义。在真菌中，还存在多形态细胞转变现象。常被称作“黑酵母”的出芽短梗霉，具有典型的细胞多形性:酵母状细胞，膨大细胞，厚垣孢子和菌丝［3-4］。酵母状细胞和菌丝之间的两形性转变曾经受到关注［5］。但是，一直没有关于出芽短梗霉多形性细胞转变规律的报道。本研究组在前期研究发现，环境pH值对出芽短梗霉菌株Aureobasidium pullulans NG多形性细胞选择转变途径影响显著［6］。为验证不同菌株是否具有响应环境pH值，发生多形性细胞转变的规律，本研究对来自荷兰菌保中心的8株A.pullulans标准菌株，以A.pullulans NG为对照进行了系统的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种出芽短梗霉(A.pullulans)NG，本实验室分离鉴定;A.pullulans CBS147.97、CBS584.75、CBS100225、CBS110373、CBS249.65、CBS110374和CBS101160，荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)。

1.1.2 培养基①菌株保藏培养基(PDA):去皮土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g;②YND培养基:每升含葡萄糖20.0 g，NaNO36.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸出粉0.2 g，KH2PO41.0 g，pH 6.0;③YPD培养基:葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母粉10.0 g，pH 6.0;④YAD培养基:葡萄糖20.0 g，(NH4)2SO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸出粉0.2 g，KH2PO41.0 g，pH 6.0;⑤磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH 2.2～7.0)［7］。

1.1.3 主要试剂葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂、NaNO3、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O等试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器SP-722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器，国华;PHS-25型数字pH计，上海理达仪器厂;SCR20BC型低温高速离心机，日立。

1.2 方法

1.2.1 细胞多形性种类和大小测定挑取PDA斜面上的保藏菌种，在固体YND平板上于25℃活化48 h，划线法接种活化的菌种于pH 6.0的YAD固体平板，25℃培养11 d，每天观察记录菌落特征，初步分析菌株是否存在酵母状细胞、膨大细胞、菌丝和厚垣孢子等多形性细胞。接种环挑取保藏菌种，接种于YND液体培养基，25℃180 r/min培养2 d，镜检观察各菌株细胞多形性，并用显微测微尺分别测定酵母状细胞、膨大细胞和厚垣孢子大小。细胞大小以10个同种类型细胞的平均值表示:长轴μm×短轴μm。

1.2.2 各菌株生长pH值三基点菌种活化及培养条件同1.2.1，25℃180 r/min培养24 h取培养液1 mL测定菌液OD560nm，测定各菌株最高、最适和最低pH值，每个样品3次重复。

1.2.3 pH值诱导细胞转变接种环挑取保藏菌种，接种于YND液体培养基，25℃180 r/min培养2 d，作为一级液体种子。按5%接种量吸取一级种子液到YND液体培养基，25℃180 r/min培养，各菌种培养时间分别为NG培养7 h、CBS147.97培养5 h、CBS584.75培养8 h、CBS100225培养7 h、CBS110373培养6 h、CBS110374培养6 h、CBS249.65培养8 h、CBS101160培养8 h，使菌种形态尽量呈酵母状，作为二级种子，测菌液OD560nm值。按10%接种量，吸取二级种子分别接种于pH为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，25℃180 r/min培养36 h，随机镜检计数100个细胞中酵母状细胞、膨大细胞和厚垣孢子的个数，每个样品3次重复。

2 结果与分析

2.1 出芽短梗霉不同菌株细胞多形性

出芽短梗霉的8个菌株均有典型的细胞多形性特征，具有酵母状细胞、膨大细胞、厚垣孢子和菌丝(表1)。CBS来源的7株菌的酵母状细胞短轴均在2.0 μm左右(1.89±0.27)～(2.41±0.25)μm，长轴伴随细胞生长变化较大(3.75±0.37)～(5.05±0.71)μm。膨大细胞短轴在3.0 μm左右(2.85±0.26)～(3.80±0.24)μm，是酵母状细胞短轴的约1.5倍(1.37～1.84)。与CBS来源的菌株比较，本实验室保存菌株NG酵母状细胞(短轴(3.76±0.71)μm)和膨大细胞(短轴(8.76±1.54)μm)个体较大，膨大细胞更典型，其短轴宽为酵母状细胞短轴的2.33倍，便于分辨。因此，NG更适宜用于研究出芽短梗霉膨大细胞的细胞转变和生理功能。膨大细胞的细胞壁加厚并积累黑色素转变成厚垣孢子，个体比膨大细胞略大一点(表1)。图1的a～d分别是CBS101160菌株的酵母状细胞、膨大细胞、菌丝和厚垣孢子形态图，其他菌株均具有这几种基本形态。8株出芽短梗霉液体培养时，以细胞形态生长繁殖为主，生长后期才有少量菌丝发育。

表1 出芽短梗霉细胞多形性Table 1 Characteristics of various polymorphic cells of A.pullulans

图1 出芽短梗霉多形性细胞(CBS101160)(40×)Fig.1 Polymorphism of A.pullulans(CBS101160)(40×)

2.2 逆境pH诱导膨大细胞转变形成分生组织状结构

分生组织状结构(meristematic structure，MS)是黑酵母中某些属，如Hortaea、Cladophialophora、Fonsecaea和Phialophora具有的一种特殊的细胞群体结构，常在低pH等逆境中形成［8］。本研究组前期结果表明，菌株NG在pH 1.5酸性培养基中可以形成分生组织状结构［6］。经过镜检发现，8株出芽短梗霉在pH 2.2或pH 7.0的缓冲液中均可形成分生组织状结构。这里以CBS 101160菌株为例，说明分生组织状结构的形成过程。在培养初期，膨大细胞与出芽繁殖的后代不分离，3～6个细胞连在一起，形成“花瓣形”结构(图2a)。膨大细胞聚集的数量越来越多，形成分生组织状结构，在液体中呈白色絮状沉淀(图2b和2c)。pH 2.2或pH 7.0超出了菌体生长适宜酸碱度范围，诱导了酵母状细胞形态变化为分生组织状结构。推测这种细胞组织方式更有利于抵抗逆境，但是具体机制还一无所知。

2.3 pH诱导细胞转变

8株菌的最低生长pH均为3，最适pH值4或5，最高生长pH值在6或7(图3)。在pH诱导细胞形态变化36 h时，绝大多数菌株的厚垣孢子还没有形成，酵母状细胞和膨大细胞为菌体的主要类型。在最适pH条件下(pH 4或5)，NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65的膨大细胞百分比达到50%，是主要细胞类型;而菌株CBS100225、CBS110373、CBS110374和CBS101160则以酵母状细胞为主要细胞类型。

图2 膨大细胞形成分生组织状结构过程(CBS101160)(40×)Fig.2 The process of cell differentiation from SC into meristematic structure(MS)(CBS101160)(40×)

图3 pH诱导多形性细胞转变(膨大细胞百分率)Fig.3 pH induces polymorphism cell differentiation(Percentage of swollen cell)

在最低生长pH以下(pH 2.2)，除CBS 249.65和CBS584.75之外的6株菌膨大细胞的比例均显著高于最适pH时的比例。酸性逆境条件可以诱导酵母状细胞转变成膨大细胞。在大于或等于最高生长pH条件下(pH 6或7)，CBS 147.97、CBS100225、CBS110374和CBS101160菌株的膨大细胞百分比达到另一个高点，显著高于最适pH时的比例。说明50%的出芽短梗霉菌株酵母状细胞转变成膨大细胞也受高pH诱导。在pH 2.2～7.0范围内，这些菌株的膨大细胞百分比随着pH值的升高，表现为先降低再升高，呈U形曲线。

CBS249.65膨大细胞百分比随pH变化呈现钟罩型曲线，在最适pH时的比例最高。推测该菌株的膨大细胞是生长繁殖的主要细胞类型，不是适应不利酸碱环境的细胞类型。CBS584.75在各个pH环境中膨大细胞百分比均超过50%，细胞转变受pH值影响较小。

供试的8株出芽短梗霉在pH 2.2或pH 7.0环境下均可形成分生组织状结构，可以确定为这个属的特性。多形性细胞转变受pH值诱导这一表型，在不同菌株中表现出不同的敏感度。供试的8株出芽短梗霉菌中，多形性细胞转变受pH值诱导的占75%，在不适宜生长的酸性条件下酵母状细胞转变为膨大细胞。其中有50%的菌株在高pH的条件下，也能启动酵母状细胞向膨大细胞的转变。

2.4 出芽短梗霉生活史

根据研究结果，综合8株出芽短梗霉细胞多形性转变的共同特征，绘制出芽短梗霉生活史(图4):1.酵母状细胞(a)转变成膨大细胞(b);2.膨大细胞(b)经过细胞壁增厚的过渡态(c)转变成厚垣孢子(d);3.膨大细胞(b)萌发出芽管(i)转变成菌丝体(l);4.膨大细胞(b)转变成有隔膨大细胞(e)，经历无隔膜的双生膨大细胞(h);5.膨大细胞(b、e)转变为分生组织状结构(j)，k为初期的分生组织状结构;6.分生组织状结构(j)芽殖产生酵母状细胞(a);7.有隔膨大细胞(e)经过细胞壁增厚的过渡态(f)转变为有隔厚垣孢子(g);8.厚垣孢子(d、g)出芽转变成菌丝体(l);9.厚垣孢子(d、g)芽殖产生酵母状细胞(a);10菌丝体(l)转变为念珠状菌丝(m);11.菌丝体(l)芽殖(n)产生酵母状细胞(a);12.念珠状菌丝(m)芽殖产生酵母状细胞(a);13.膨大细胞(b)芽殖产生酵母状细胞(o)。

在出芽短梗霉生活史中，酵母状细胞、膨大细胞和菌丝是生长繁殖的细胞类型;厚垣孢子和念珠状菌丝是休眠体;分生组织状结构抗性很强，有助于细胞度过逆境。在最适宜生长条件下，有一些菌株以酵母状细胞为生长繁殖的主要类型(CBS100225、CBS110373、CBS110374和CBS101160)，还有一些则是以膨大细胞为主(NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65)。膨大细胞是细胞多形性转变的中心环节，在不同的环境条件下可以转变成菌丝、厚垣孢子或分生组织状结构，还能够出芽繁殖(图4)。膨大细胞是一种稳定的细胞类型［6］，以往被认为仅仅是酵母状细胞和厚垣孢子之间的过渡态，在出芽短梗霉生活史中的作用被显著的低估了。

图4 出芽短梗霉生活史Fig.4 Life cycle of A.pullulans

3 讨论

出芽短梗霉细胞转变特征表现出一定规律，菌株间也存在一定差异。在液体发酵过程中，不同的菌株的主要细胞类型可能是菌丝、酵母状细胞或膨大细胞。现已发现，合成并分泌普鲁兰糖的是膨大细胞，不是菌丝和酵母状细胞［6］。因此，在液体培养中以膨大细胞为主要生长繁殖类型的菌株NG、CBS147.97、CBS584.75和CBS249.65更适合发酵普鲁兰糖。菌株NG、CBS147.97、CBS249.65和CBS584.75的细胞转变特征各不相同。随着培养基pH上升，膨大细胞百分比分别呈现出逐渐降低、U形曲线、钟罩型曲线和基本不受影响的不同规律。本研究组已经证明，在发酵过程中，可以通过控制pH值诱导NG酵母状细胞转变为合成普鲁兰糖的膨大细胞，提高普鲁兰糖合成水平。对于细胞转变规律不同的菌株，是否可以采用控制pH值调节膨大细胞比例的方案发酵普鲁兰糖，将在后续的研究中验证。

致谢:CBS147.97等7株A.pullulans受赠于荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)G.S.De Hoog教授，特此衷心感谢!

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