TMPRSS4和onfFN在甲状腺细针吸标本中的定量表达

姚晓峰 张 仑 张 强 曹晓莉

细针吸细胞学检查(FNAB)是甲状腺癌诊断和鉴别诊断的常用方法，它操作简单、安全、快捷，并且具有较高的特异性和准确率。但是，FNAB也有一定的局限性和缺陷，由于细胞结构特点不明显或取材不当而导致无法明确诊断，在临床应用中受到一定的限制。本实验应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，检测甲状腺细针吸组织中TMPRSS4和onfFN mRNA的表达量，并探讨其与FNAB联合对甲状腺癌诊断和鉴别诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

收集天津医科大学附属肿瘤医院2006年1月至2007年7月。甲状腺细针吸标本78例，其中术后病理检查证实为甲状腺癌45例，其中乳头状癌29例，滤泡癌9例，髓样癌5例，未分化癌2例；男性18例，女性27例，年龄8～79岁，平均年龄48.5岁。甲状腺良性病变33例，其中结节性甲状腺肿16例，腺瘤13例，桥本氏甲状腺炎4例；男性13例，女性20例，年龄16～72岁，平均年龄44岁。所有病例均行超声引导下的细针吸细胞学检查，其中一部分标本用于涂片后细胞学检测，另一部分放入装有TRIzol试剂试管内，然后在-80℃的冰箱内冻存。

1.2 荧光定量RT-PCR

TRIzol法提取甲状腺细针吸标本的RNA，微量核酸检测仪测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳判断提取RNA的质量。引物与探针的设计采用Oligo 6.0软件。TMPRSS4的引物和探针：Forward5′- CTG，CCT，TGG，GGT，GAC，AAT，CT-3′，Reverse5′- CAT，CGA，GGC，TGT，TCA，GAG，GTT-3′，Probe5′(FAM)- GGG，AGG，ATC，ACA，GAG，CCA，GCA，TGT，T-3′(TAMRA)。onfFN的引物和探针：Forward5′- GAG，GTG，CCA，CCT，ACA，ACA，TCA，TA -3′，Reverse5′- AGG，GGT，CAA，AGC，ACG，AGT，CAT-3′，Probe5′(FAM)- ACC，GTG，GGC，AAC，TCT，GTC，AAC，GAA，G -3′(TAMRA)。GAPDH的引物和探针：Forward5′- GAA，GGT，GAA，GGT，CGG，AGT，C -3′，Reverse5′- GAA，GAT，GGT，GAT，GGG，ATT，TC-3′，Probe5′(FAM)- CAA，GCT，TCC，CGT，TCT，CAG，CC -3′(TAMRA)。引物和探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实验步骤按照试剂盒(Invitrogen)说明书进行。荧光定量RT-PCR结果的计算：目的基因的标准值=2-(目的基因的Ct值-GAPDH的Ct值)，Ct值表示PCR循环阈值。

1.3 统计学方法

所用数据均采用SPSS13.0 for windows 统计软件处理，良恶性肿瘤的比较采用t检验， TMPRSS4与onfFN的相关性采用线性相关检验。

2 结果

2.1 TMPRSS4、onfFN的表达情况

RT-PCR结果显示：甲状腺癌和甲状腺良性病变组织中TMPRSS4和onfFN mRNA的平均表达量分别为15.236±9.685、0.569±0.374和25.318±15.642、0.865±0.219，恶性与良性组织中两者表达差异均有统计学意义(P均=0.000)，2种分子标志物在甲状腺癌组织中的表达呈正相关性(γ=0.374,P=0.026)。

2.2 TMPRSS4和onfFN mRNA表达与甲状腺癌临床病理参数的关系

由表1可见， TMPRSS4 mRNA和onfFN mRNA的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小无相关性，而与淋巴结转移和TNM分期显著相关(P=0.009、P=0.015和P=0.024、P=0.08)。

表1 OnfFN和TMPRSS4表达与甲状腺癌临床病理参数的关系

3 讨论

TMPRSS4功能上具有胰酶活性，可能在肿瘤的转移和浸润过程中起重要作用，除了胰腺癌在其它恶性肿瘤中TMPRSS4表达水平也提高，例如胃癌、结肠癌和直肠癌等，在软组织肉瘤和乳腺癌中不表达，在正常的心、脑、肺、肝、骨骼肌、胎盘、子宫和脂肪组织中不表达，而在正常消化道和泌尿生殖道中微量表达。由此可见，TMPRSS4表达存在着组织特异性和肿瘤特异性，并且这种表达的提高不出现在炎症组织中，这些都表明它与肿瘤有着密切的关系[1]。关于TMPRSS4在甲状腺癌中的表达情况研究的很少，Electron Kebebew等[2]通过cDNA微阵列技术筛选出差异表达基因TMPRSS4，并经过定量RT-PCR验证发现，它在甲状腺癌中的高度表达，尤其是在滤泡样癌和乳头状癌滤泡亚型中高度表达，但表达水平与原发肿瘤大小及淋巴结是否转移无关。本实验研究结果显示：TMPRSS4 mRNA在甲状腺癌中的表达量高于甲状腺良性肿瘤， TMPRSS4表达与肿瘤患者性别、年龄及肿瘤大小无关，而与淋巴结是否转和TNM分期有关，在有淋巴结转移和TNM Ⅲ+Ⅳ期的标本中的表达水平要高于无淋巴结转移和TNMⅠ+Ⅱ期的组织，说明TMPRSS4在甲状腺癌的转移和进展过程中可能起到了至关重要的作用。

癌胚纤维连接蛋白(onfFN)是1个相对分子量为(310～335)×103的糖蛋白，正常情况下由子宫内皮下的滋养层细胞和胚胎细胞分泌，作为胎盘的生物胶存在，在妊娠早期存在，而37周以后就会减少[3]。病理情况下在某些肿瘤组织细胞中高度表达，而在正常成人组织中不表达或微量表达，不同的肿瘤组织中表达也存在着明显的差异，与肿瘤的侵袭和转移关系密切。很多研究表明，onfFN在多种恶性肿瘤中高度表达，例如在肺癌、子宫等[4，5]中都有表达。在甲状腺癌中它的表达水平同样升高，E Hesse等[6]应用cDNA微阵列技术，筛选出甲状腺癌中onfFN的表达存在差异，应用RT-PCR也证实了这一差异，发现在甲状腺乳头状癌(PTC)中阳性率为98％，在甲状腺滤泡癌(FTC)阳性率为78％。同时，监测了外周血中正常细胞的表达情况，发现在正常的血细胞中无onfFN表达，这些说明通过检测外周血中onfFN的表达可以用于甲状腺微小转移的监测，将肿瘤组织的残留降到最低，同时还可以用于评估恶性肿瘤治疗方案的效果。本实验结果表明，onfFN mRNA在甲状腺癌中的表达量要高于良性甲状腺病变，同时，onfFN表达与肿瘤患者性别、年龄、肿瘤大小无关，而与患者有无淋巴结转移及TNM分期相关，有淋巴结转移和TNM Ⅲ+Ⅳ期标本中onfFN表达要高于无淋巴结转移和TNMⅠ+Ⅱ期组织，并且onfFN与TMPRSS4在甲状腺癌中的表达呈正相关，说明onfFN与TMPRSS4一样可能在甲状腺癌的进展和转移过程中起到一定的作用，而且在此过程中两者起到了协同作用。

随着现代分子生物学技术的不断发展，对甲状腺癌分子标志物的研究会越来越深入，相信它在临床的应用前景非常广阔，尤其是与细针吸细胞学检查联合后，对甲状腺病变的术前诊断和鉴别诊断具有很高的临床实用价值，为临床制定治疗方案提供准确的信息。

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[4]Nanki N,Fujita J,Yang Y,et al.Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines〔J〕.Tumour Biol,2001,22(6):390.

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[6]E Hesse,PB Musholt,E Potter，et al.Oncofoetal fibronectin-a tumour-specific marker in detecting minimal residual disease in differentiated thyroid carcinoma〔J〕.British Journal of Cancer ,2005,93:565.