乳腺癌中VEGF基因mRNA的表达及其与临床病理因素的关系

张景华 张德才 何 津 汪 萍 马 杰 牛凤玲

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，癌细胞转移是导致发病率和死亡率上升，影响乳腺癌治疗效果的主要原因。我们对乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织中VEGF mRNA及其蛋白表达水平进行检测，同时分析其与HER-2，ER,PR蛋白表达的关系以及其在乳腺癌临床生物学中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2007年7月至2008年5月华北煤炭医学院附属唐山市肿瘤医院乳腺肿瘤科女性乳腺癌48例和乳腺纤维腺瘤患者20例为研究对象，患者年龄(55.3±9.97)(29～79)岁。患者术前未接受任何相应治疗，且资料完整。为了排除不同病理分类对研究的影响，故纳入本实验中的48例乳腺癌全部为浸润性导管癌。每例标本离体5 min内将各组织各0.1 g，置于液氮中暂存，液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测乳腺癌组织中VEGF mRNA表达 ① 引物设计、合成由Genebank中查出基因的位置，用Primer 5.0设计引物，并由北京三博远志生物技术有限公司合成。VEGF上游引物5'-GGAGGCAGAGAAAAGAGAAAG-3'，下游引物 5'-TCAGGGAGAGAGAGTTGG- AA-3'。GADPH 上游引物5'-GACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，下游引物5'- CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3'。② 组织总RNA的提取：采用Trizol(invitrogen公司)一步法，按说明书操作。称取约100 mg冻存的组织块，置冰上，匀浆管内充分匀浆，反复离心，洗脱，提取总RNA，紫外分光光度仪测定其纯度和含量，1％甲醛变性凝胶电泳检测其完整性。③ cDNA 的合成：取RNA约2 μg加入逆转录反应体系( 10×PCR 反应缓冲液 2 μl,dNTP混合液 2 μl ，Oligo-dT15 2 μl，正向引物1 μl ，反向引物1 μl，加去离子双蒸水至终反应体系20 μL，37℃孵育60 min。④ PCR扩增：反应体系20×SYBR solution 9 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，DNA模板2 μl，加超纯水至20 μl。将PCR反应管置入ROTOR GENE 3000实时定量PCR仪内， 95℃预变性5 min， 94℃变性30 s，58℃退火 1 min， 72℃延伸 1 min，40个循环反应结束，得出目的基因的Ct值。Ct值为设荧光强度阈值0.05时的循环数，以目的基因的Ct值减去内参GAPDH的Ct值得到△ct值，2-△ct即为目的基因相对于内参GAPDH的相对表达量[1]。提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳，观察28 s和18 s条带，以条带清晰且28 s的亮度约为18 s的二倍为最佳标准。用紫外分光光度计260 nm定量OD260/OD280比率进行纯度测定，比值在1.8～2.0为最佳，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 PCR扩增产物特异性的确定 PCR产物经单一熔解曲线峰进行确定，并将PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，与DNA分子量参照物(markers)对比基因大小，以出现明显与目的基因碱基相同的区带为阳性。

1.2.3 免疫组化检测乳腺癌组织中VEGF蛋白的表达 浓缩型兔抗人VEGF多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司；1∶50)。即用型SABC试剂盒及浓缩型DAB显色试剂盒(武汉博士德)。取乳腺癌、乳腺良性肿瘤组织标本经10％福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规免疫组化SABC法进行染色。对照以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准

以细胞质中有棕黄色颗粒为阳性细胞。VEGF,ER,PR免疫组化阳性判定标准采用4级分法：无阳性细胞为(-)，0分；阳性细胞数≤25％为(+)，1分；>25％～50％为(++)，2分；>50％为(+++)，3分。再结合染色强度：无着色细胞为(-)，0分；浅黄色为(+)，1分；棕黄色(++)，2分；棕褐色为(+++)，3分。2个分值相加即为该标本的免疫组化阳性计分：0～1分为阴性，记为(-)；2～3分为弱阳性，记为(+)；4分为中度阳性，记为(++)；5分以上强阳性，记为(+++)。在本研究的统计中，将阴性患者记为(-)，其他3个级别的阳性患者均统计为(+)。HER-2的检测标准依据美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学家学会报告进行，阳性定义为：免疫组织化学染色(+++)[2]

1.4 统计学方法

所得数据采用SPSS13.0统计软件进行分析。阳性率的比较应用χ2检验、秩和检验及精确概率法，应用Spearman进行相关分析；计量资料采用方差分析，均以P<0.05作为判断差别显著性的标准。

2 结果

2.1 VEGF在乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中的表达

VEGF mRNA见2条特异性条带228 bp、365 bp分别代表VEGF121、VEGF165 2种异构体(图1)。PCR产物半定量分析:VEGF121mRNA、VEGF165mRNA在乳腺癌中表达分别是0.5733±0.1764、0.310±0.098；在乳腺纤维腺瘤中表达为0.2961±0.0845、0.2657±0.0342。乳腺癌组织的VEGFmRNA阳性表达率均显著高于乳腺纤维腺瘤组织(P<0.05),VEGFmRNA在乳腺癌细胞中表达扩增，见图2。VEGF蛋白主要表达在胞质中，光学显微镜示胞质内含有棕黄色或棕褐色颗粒的细胞被计数为阳性细胞。VEGF在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中的阳性表达率分别为95.8％(46/48)、10.0％(2/20)。VEGF在2种组织中阳性率差异有统计学意义(χ2=38.140，P=0.000)。实时荧光定量RT-PCR与免疫组化结果基本一致。

图1 乳腺癌组织中VEGF mRNA表达的PCR产物凝胶电泳分析图2 乳腺癌组织VEGF mRNA的扩增曲线结果

2.2 HER-2在乳腺癌及乳腺纤维腺瘤中的表达

HER-2在乳腺癌及乳腺纤维腺瘤中的表达分别为18.8％(9/48)、0(0/20)，两者差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 VEGF、HER-2蛋白表达与乳腺癌临床病理学及其生物学特性的关系

乳腺癌组织的VEGF蛋白表达与患者的年龄、淋巴结转移、肿块大小、组织学分级、pTNM分期等临床病理因素无关(P>0.05)。HER-2蛋白表达与pTNM分期相关(P<0.05)，见表1。

2.4 乳腺癌中VEGF，HER-2，ER,PR蛋白表达的相关性

Spearman进行相关分析:VEGF的蛋白表达与HER-2，ER,PR不相关(P>0.05)。HER-2与ER,PR的表达呈负相关(γ=-0.335，P=0.005；γ=-0.300，P=0.012)，见表2。

表1 VEGF,HER-2蛋白表达与乳腺癌临床病理因素的关系

表2 乳腺癌中VEGF、HER-2、 ER、PR的相关性

注：Spearman相关分析：HER-2与ER,PR的表达呈负相关，P<0.05

3 讨论

1983年发现的血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，在1989年被证实与牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的VEGF是由同一基因编码的同种蛋白。目前已发现VEGF有5种异构体，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。本研究结果检测到乳腺组织中VEGF mRNA有2种,即VEGF121和VEGF165。VEGF145、VEGF189和VEGF206未检测出,可能因其含量太少,或与其具有组织特异性有关。Scott等[3]研究发现VEGF mRNA在乳腺癌中表达显著高于正常乳腺组织(121>165>189),只有VEGF165蛋白能表达。Jobim等[4]对VEGF的表达与乳腺癌的临床病理特征关系的研究表明，VEGF的阳性表达与患者的年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移均没有相关性。Yamasaki等[5]检测VEGF mRNA在乳腺癌组织中表达，同样未发现与肿瘤大小及淋巴结状态有关，与本研究结果一致。

原癌基因HER-2，又称C-erbB-2或neu，是生长因子受体家族成员之一，位于染色体17q21。该基因的表达产物为185 kD的跨膜糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性，可促使肿瘤细胞发生恶性转化。Hussein等[6]研究发现原癌基因HER-2在乳腺癌中的阳性表达率为10％～34％，其表达与预后不良有关，尤其在浸润性导管癌中HER-2蛋白的表达明显高于导管内癌；另外证明HER-2与ER呈负相关，即该基因的激活在ER阴性的肿瘤患者中较常见。本研究结果也支持前述研究，即HER-2的阳性表达率为18.8％，HER-2与ER、PR均呈负相关(P<0.05)。本研究还证明，HER-2蛋白阳性表达率与年龄、淋巴结转移情况、肿瘤大小、组织学分级无关(P>0.05)，但HER-2在不同pTNM分期的乳腺癌患者中阳性表达有显著差异，说明HER-2的表达与乳腺癌患者的分期相关，提示HER-2基因可能作为判断乳腺癌预后的1个重要参考指标。

实时RT-PCR是1种能精确测定基因mRNA表达水平的荧光检测系统,在每一个RT-PCR循环的延伸阶段,基因产物都有一次定量检测,这种新方法和传统RT-PCR相比有很多优点。本研究中应用实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤的VEGF mRNA的表达情况，用免疫组化方法检测其蛋白和HER-2与、ER、PR蛋白的关系。我们发现乳腺癌组织的VEGF mRNA和蛋白的阳性表达率均显著高于乳腺纤维腺瘤组织，VEGF在不同年龄、淋巴结转移状况、组织学分级、肿瘤大小、pTNM分期的乳腺癌患者中表达差异无统计学意义。HER-2在乳腺癌患者中的表达与ER,PR的表达成负相关。

[1]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△CT Method〔J〕.Methods,200l,25(4):402.

[2]Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer〔J〕.J Clin Oncol，2007，25(1):118.

[3]Scott PA,Smith K,Poulsom R,et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor mRNA vs protein isoform expression in human breast cancer and relationship to eIF-4E〔J〕.Br J Cancer,1998,77(12):2120.

[4]Jobim FC,Schwartsmann G,Xavier NL,et al.Expression of MMP-9 and VEGF in breast cancer:correlation with other prognostic indicators〔J〕.Rev Bras Ginecol Obstet,2008,30(6):287.

[5]Yamasaki T,Tsuda H,Imazeki N,et al.Vascular endothelial growth factor mRNA levels quantified by reverse transcription-polymerase chain reaction in microdissected breast carcinoma tissues are correlated with histological type and grade of both invasive and intraductal components〔J〕.Pathol Int,2005,55(5):255.

[6]Hussein MR,Abd-Elwahed SR,Abdulwahed AR.Alterations of estrogen eceptors,progesterone receptors and C-erbB-2 oncogene protein expression in ductal carcinomas of the breast〔J〕.Cell Biol Int,2008,32(6):698