HIF-1α基因沉默对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长及survivin表达的影响

沈圆兵 陈余清 王效静 李 伟 舒红梅

前期体外实验研究证实，HIF-1α和survivin在NSCLC中呈高表达，HIF-1α与survivin潜在启动子结合上调survivin基因的转录活性，且对survivin启动子的调控具有肿瘤特异性[1]。Li等[2]认为HIF-1α在不同肿瘤中对抑制肿瘤生长的效果不同，沉默HIF-1α的表达能否抑制肺癌的生长，且对survivin的表达是否有无影响，目前国内外未见此相关报道。因此，我们采用HIF-1α稳定转染的Mi RNA质粒的A549细胞构建裸鼠移植瘤模型，观察HIF-1α基因沉默对移植瘤生长及survivin表达的影响，进一步探讨HIF-1α在肺癌发病中的分子机制，为肺癌靶向治疗提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

荷瘤雄性裸鼠15只，4～6周龄，体重18～24 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF环境下饲养。

1.2 主要试剂

分别转染HIF-1α-Mi RNA、无意义序列Mi RNA，空质粒载体的A549细胞株由实验室前期构建并保存，以含10％胎牛血清的HAMs-F12完全培养基培养；鼠抗人HIF-1α和鼠抗人survivin单克隆抗体购自Santa公司，逆转录及PCR试剂盒购自Fermentas公司；TUNEL检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 A549荷瘤鼠模型的建立及基因治疗观测 将裸鼠随机分为3组，每组5只，收集处于对数生长期的3组A549细胞株[空白对照组、无意义序列转染组和实验组(稳定转染HIF-1α-MiRNA的真核表达载体)],胎盘蓝检测细胞活力在90％以上，每只裸鼠背部皮下接种各组处理细胞悬液0.1 ml，每3 d测量1次肿瘤的长径和短径，根据公式(肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2×0.52)计算肿瘤体积，观察3组荷瘤鼠的肿瘤生长情况，接种60 d后，颈椎脱臼处死裸鼠，剥离肿块并称重，计算抑瘤率。

1.3.2 免疫组化染色 严格按照免疫组化SP试剂盒说明书进行操作，参照Couzin等[3]的细胞计数，用高倍视野(×400)计数500个细胞，阳性细胞率(％)=阳性细胞数/总细胞数×100％，HIF-1α和survivin阳性反应以胞质或胞核内见棕黄色颗粒。

1.3.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法半定量检测肿瘤组织中HIF-1α、survivin mRNA的表达 收集各组组织细胞约6×106个，Trizol法提取细胞总RNA，以cDNA为模板，进行PCR反应，扩增HIF-1α、survivin片段。测定PCR产物cDNA条带和GAPDH内参照条带的吸光度(A)值的比值，作为HIF-1α、survivin mRNA的相对表达量。PCR反应的引物序列及产物大小见表1。

1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡 按照碧云天TUNEL试剂盒说明书进行，荧光显微镜下观察凋亡细胞呈绿色荧光，高倍镜(×400)下随机选择10个视野,计数凋亡细胞数量并计算平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 3组裸鼠的肿瘤生长情况

以皮下瘤体结节直径>0.5 cm为接种成瘤标准，3组裸鼠成瘤率为100.0％，无1例死亡。由表2可见，皮下成瘤后3组肿瘤的生长趋势无明显区别，接种后第25天开始，空白对照组和无意义序列转染对照组肿瘤体积均显著大于实验组(P均<0.05)，45天后具有显著性差异(P<0.01)。接种后第60天，处死裸鼠，剥离肿瘤(图1)并称重，实验组肿瘤组织瘤体重量明显低于对照组(P<0.01)，抑瘤率高达68.9％(表3)。

表1 引物序列及扩增长度

表2 各组肿瘤体积的比较(±s)

表2 各组肿瘤体积的比较(±s)

组别肿瘤体积(mm3)10天16天25天45天54天60天HIF⁃1αmiRNA97．47±9．29143．48±10．12263．75±15．01∗499．88±32．55∗∗622．58±33．84∗∗746．65±70．70∗∗无意义序列107．26±13．45163．19±14．11296．89±20．00∗646．18±76．14∗∗834．80±88．73∗∗989．15±114．93∗∗正常104．33±10．67164．28±19．95295．94±29．65∗660．89±72．01∗∗852．38±90．01∗∗1004．80±111．65∗∗

注：与HIF-1α MiRNA组比较，*为P< 0.05，**为P< 0.01

图1 3组裸鼠移植瘤剥离后的瘤体变化

1为实验组;2为无意义序列转移组;3为空白对照组

表3 各实验组对裸鼠移植瘤的抑瘤率

2.2 免疫组化染色结果

免疫组化染色结果显示，实验组HIF-1α和survivin表达强度分别为(24.56±5.83)％和(29.08±3.99)％，明显低于空白对照组[(69.88±6.66)％和(72.40±5.29)％]和无意义序列转染组[(65.52±5.83)％和(68.88±4.47)％]，P均<0.01，两对照组间差别无统计学意义，P>0.05。

2.3 HIF-1α和survivin mRNA的表达结果

HIF-1α和survivin RT-PCR检测结果见图2和图3。实验组肿瘤组织中HIF-1α 和survivin mRNA的相对表达量分别为0.06±0.01和0.44±0.21，明显低于空白对照组(0.71±0.11和1.24±0.09)和无意义序列转染组(0.64±0.15和1.23±0.04)(P<0.01)。空白对照组与无意义序列转染组比较HIF-1α和survivin mRNA表达的差异均无统计学意义(P均>0.05)。

图2 RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达

1为实验组;2为无意义序列转移组;3为空白对照组

图3 RT-PCR检测survivin mRNA表达

1为空白对照组;2为无意义序列转移组;3为实验组

2.4 细胞凋亡检测结果

TUNEL法检测结果显示,实验组凋亡细胞数为6.10±1.19，显著高于空白对照组3.30±0.95和无意义序列对照组2.70±0.82,P<0.01,见图4。

图4 细胞凋亡数量统计情况

3 讨论

肺癌是目前全球死亡率最高的恶性肿瘤，在我国，肺癌发病率呈逐年上升趋势，现已成为我国城市人口癌症死亡的首要原因。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占85％，据统计，肺癌患者的5年生存率约为8.9％[4]，在实体瘤中，10％～35％的肿瘤细胞处于乏氧状态，细胞内HIF-1α表达增强是肿瘤细胞适应乏氧的1个重要原因[5]。目前，已在多种恶性肿瘤如子宫颈癌、肺癌、头颈部癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、胃癌等肿瘤及癌前病变中检测到HIF-lα蛋白的过表达[6]，Fan等[7，8]研究发现，肿瘤分期越晚，HIF-1α表达越高，且越是发生转移的肿瘤组织，HIF-1α表达率就越高。有研究[9]报道HIF-1α介导肿瘤细胞导致的放化疗抵抗，而且使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移，导致治疗失败，HIF-1α的诸多特性使得HIF-1α成为抗癌治疗的主要靶点。因此，研究以HIF-1α为靶点的肺癌基因治疗具有重要的临床意义。

本实验在前期研究的基础上，应用基因沉默技术，已成功筛选出稳定转染MiRNA质粒的肺腺癌A549细胞株，通过构建裸鼠皮下移植瘤模型，进一步在体观察HIF-1α基因沉默对裸鼠移植瘤生长和survivin表达的影响。结果表明实验组HIF-1α mRNA和蛋白表达均显著降低，肿瘤生长受到抑制，肿瘤组织细胞凋亡明显增加，survivin mRNA和蛋白表达也显著降低，与各对照组相比，差异具有统计学意义，提示HIF-1α基因沉默有效抑制移植瘤生长，肿瘤细胞凋亡明显增加可能与survivin表达下调有关。

survivin是凋亡抑制蛋白家族中相对分子量最小的成员，但也是迄今发现最强的凋亡抑制因子[1]，其抗凋亡机制主要是通过直接或间接抑制Caspase活性而发挥抗凋亡作用，目前，有研究发现在乳腺癌[10]、胰腺癌[11]、结直肠癌[12]中的过表达的HIF-1α上调survivin表达，体外研究采用HIF-1α基因沉默导致survivin的表达下调，表明两者存在显著正相关，Chen和Kirito等[13，14]研究发现HIF-1α对Notch-1和胰岛素样生长因子受体诱导的survivin的表达有协调作用，表明HIF-1α在survivin的表达调控中起着非常重要的作用，Sun等[15]在胰腺癌的在体研究发现HIF-1α和survivin的表达无相关性，可能是由于体外的人工缺氧环境不能完全模拟实体瘤内部的真实的缺氧条件，因此本实验进一步在体探讨HIF-1α基因沉默对移植瘤生长及survivin表达的影响，结果显示实验组survivin mRNA和蛋白表达显著降低，凋亡细胞数量显著增加，表明HIF-1α基因沉默抑制裸鼠移植瘤生长可能部分原因是由于下调survivin表达导致肿瘤细胞凋亡增加所致。

HIF-1α靶向治疗现已成为肿瘤治疗的热点，临床的应用前景有赖于我们对于乏氧调节肿瘤生长机制更深人的理解，随着人们对HIF-1α参与肺癌发病机制的进一步阐明，进而可能以此为基础开辟肺癌基因治疗的新途径。

[1]Chen YQ,Zhao CL,Li W.Effect of hypoxia-inducible factor-1alpha on transcription of survivin in non-small cell lung cancer〔J〕.Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2009,28(1):1.

[2]Li X,Lu Y,Liang K,et al.Requirement of hypoxia-inducible factor-1alpha down-regulation in mediating the antitumor activity of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab〔J〕.Mol Cancer Ther,2008,7(5):1207.

[3]Couzin J.Breakthrough of the year:RNAs make big splash〔J〕.Science，2002,298:2296.

[4]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer Clin,2005,55(2):74.

[5]Kunz M,Ibrahim SM.Molecular responses to hypoxia in tumor cells〔J〕.Mol Cancer,2003,2:23.

[6]Rankin EB,Giaccia AJ.The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis〔J〕.Cell Death & Differentiation,2008,15(2):678.

[7]Fan LF,Dong WG,Jiang CQ,et al.Role of hypoxia-inducible factor-1a and survivin in colorectal carcinoma progression〔J〕.Int J Colorectal Dis ,2008,23(11):1057.

[8]Denko NC.Hypoxia,HIF-1 and glucose metabolism in the solid tumour〔J〕.Nat Rev Cancer,2008,14(8):705.

[9]Unruh A,Ressel A,Mohamed HG,et al.The hypoxia-inducible factor-1a is a negative factor for tumor therapy〔J〕.Oncogene,2003,22(21):3213.

[10]Zhang QZ,Tang XD,Zhang ZF,et al.Nicotine induces hypoxia-Inducible factor-1AExpression in human lung cancer cells via nicotinic acetylcholine receptor-mediated signaling pathways〔J〕.Clin Cancer Res,2007,13(16):4686.

[11]Shyu KG,Hsu FL,Wang MJ,et a1.Hypoxia—inducible factor 1 alpha regulates lung adenocarcinoma cell invasion〔J〕.Exp Cell Res,2007,313(6):1181.

[12]Sotarou Enatsu,Akinori Iwasaki,Takayuki Shirakusa,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and its prognostic significance in small-sized adenocarcinomas of the lung〔J〕.European Journal of Cardio-thoracic Surgery ,2006,29 :891.

[13]Chen YQ,Li DM,Liu HL,et al.Notch-1 signaling facilitates survivin expression in human non-small cell lung cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther,2011,11(1):1.

[14]Hu Y,Kirito K,Yoshida K,et al.Inhibition of hypoxia-inducible factor-1 function enhances the sensitivity of multiple myeloma cells to melphalan〔J〕.Mol Cancer Ther,2009,8(8):2329.

[15]Hong-Cheng SUN,Zheng-Jun QIU,Jun LIU.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis〔J〕.Int J Oncol,2007,30(6):1359.