免疫亲和柱-高效液相色谱法检测乳制品中氯霉素

李应国，赵旭博，张雷，李贤良，郗存显，王国民，王雄，果旗，李正国

（1.重庆大学生物工程学院，重庆 400044；2.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100；3.重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆 400020；4.北京中检维康技术有限公司，北京 100044）

免疫亲和柱-高效液相色谱法检测乳制品中氯霉素

李应国1，3，赵旭博2，张雷3，李贤良3，郗存显3，王国民1，3，王雄4，果旗4，李正国1

（1.重庆大学生物工程学院，重庆 400044；2.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100；3.重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆 400020；4.北京中检维康技术有限公司，北京 100044）

建立免疫亲和柱富集净化、高效液相色谱-紫外法快速测定牛奶和奶粉中氯霉素残留物。样品用乙酸乙酯提取，经免疫亲和色谱柱纯化，应用液相色谱-紫外法检测。结果表明，牛奶和奶粉添加氯霉素，回收率为79.6%～108.6%，变异系数小于10%；方法检测灵敏度0.1 μg/L。该方法能够特异性的纯化牛奶和奶粉样品中的氯霉素，免疫亲和柱（IAC）净化是一种简单，快速，准确的方法。

氯霉素残留物检测；免疫亲和柱净化富集；液相色谱-紫外法；牛奶

0 引言

氯霉素是一种常用的具有旋光活性的广谱抗生素，治疗畜禽肠道感染有特效，至今已有50年的使用历史[1]。

氯霉素的抗菌效果虽然很好，但它的副作用很大，1999年9月13日农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》的通知，规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出[2]。目前，氯霉素的测定方法有高效液相色谱法[4]、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、酶免疫检测法等[3]。本文研究了免疫亲和柱净化高效液相色谱-紫外法测定牛奶和奶粉中的氯霉素残留量，该方法具有简单，快速，准确，灵敏度高等特点。

1 材料和方法

（1）仪器。高效液相色谱仪（HITACHI），紫外检测器（HITACHI），高速离心机，泵流操作架。

（2）主要试剂。氯霉素免疫亲和柱；氯霉素标准品。

（3）液相色谱条件：色谱柱为Cloversil-C18，4.6× 150 mm（5 um），流动相为甲醇:水=50∶50（体积比），流速为0.8 mL/min。检测器为紫外检测器，波长278 nm，进样体积为50～100 uL。

（4）氯霉素标准品的配制与标准曲线的建立。标准品用流动相配制，质量浓度分别为2，5，10，20，50 μg/L，注入液相色谱检测，建立标准曲线。

1.1 样品处理方法

1.1.1 牛奶[5]

（1）准确量取牛奶样品20 mL，准确加入20.0 mL乙酸乙酯，摇床震荡提取30 min，然后以转速4000 r/min离心10 min。

（2）准确吸取上清液10.0 mL，于60℃氮气下吹干，然后用10 mL质量分数为5%乙腈水复溶，用玻璃纤维滤纸过滤；收集滤液于干净烧杯中。

（3）将上述滤液10.0 mL（10.0 mL样品），以1滴/s的流速全部通过氯霉素免疫亲和柱，直至空气流经亲和柱，随后用10.0 mL纯水以1～2滴/秒的流速淋洗亲和柱，直至空气流经亲和柱。

（4）将玻璃小管置于亲和柱下，用1.0 mL甲醇以1滴/秒淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收集于玻璃测试管中，于60℃氮气下吹干，然后用流动相定容500 μL，注入HPLC检测。

1.1.2 奶粉

准确称取5 g奶粉，加入50 mL温水（50℃）溶解，充分混匀。然后按照1.5.1牛奶的试验方法操作。

1.2 添加回收实验

分别选择牛奶和奶粉样品进行添加回收实验，牛奶样品分别添加质量浓度为0.5，1，2 μg/L 3个梯度；奶粉样品分别添加质量分数为5，10，20 ng/g 3个梯度。每个实验做5组平行试验，计算回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与色谱图

氯霉素标准品质量浓度分别为2，5，10，20，50 μg/L建立标准曲线，结果如图1所示。氯霉素标准品质量浓度与峰面积的标准曲线方程为y=532x-54，R2= 0.9999，氯霉素质量浓度为10 μg/L色谱如图2所示。

2.2 样品添加回收率

牛奶和奶粉样品添加回收率结果：牛奶样品回收率在79.6%～108.6%之间，变异系数小于10%，结果如表1所示。奶粉样品回收率在79.8%～107.2%之间，变异系数小于10%，结果如表2所示。

表1 牛奶添加回收率结果

表2 奶粉添加回收率结果%

本研究中，免疫亲和柱富集净化方法，能够很大的提高样品的检测灵敏度，牛奶样品浓缩了20倍，奶粉样品浓缩了2倍。实验中液相色谱灵敏度能够达到2 μg/L，因此，本研究方法，牛奶的检测灵敏度为0.1 μg/L，奶粉的检测灵敏度为1.0 ng/g。

牛奶样品中添加质量浓度为1.0 μg/L检测色谱如图3所示。

3 结论

本研究建立的免疫亲和柱富集净化-高效液相色谱-紫外法检测牛奶和奶粉中氯霉素残留量，样品前处理简单，免疫亲和层析净化富集效果明显，很大的提高了样品的检测灵敏度，牛奶样品的灵敏度为0.1 μg/L，奶粉样品的灵敏度为1 ng/g；样品添加回收率在79.6%～108.6%之间，变异系数小于10%；该方法适用于牛奶和奶粉中的氯霉素的快速检测。

[1]胡顶飞,沈建忠.氯霉素类抗生素的残留分析[J].中国兽药杂志，2001，35(5)：55-57.

[2]中华人民共和国农业部.关于下达2001年兽药残留监控计划的通知[J].兽医公报，2001，3(6)：13-14.

[3]刘智宏.酶标免疫测定法在检测动物性食品中氯霉素残留的应用[J].中国兽药杂志，1995，29(2)：47-48.

[4]陈家华.高效液相色谱快速测定家禽组织中氯霉素残留研究[J].中国抗生素杂志，1992，17(5)：351-355.

[5]ALLEN E H.Review of Chromatographic Methods for Chloramphenicol Residues in Milk,Egg,and Tissues from Food Producing Animal[J].J.Assoc off Anal Chem,1985,68：990-999.

[6]HAMBURGER R N.Chloramphenicol-Specific Antibody[J].Science,1966,152:203-205.

[7]ANNA Y K,JEANNE V S.Competitive ELISA of Chloramphenicol: Influence of Immunoreagent Structure and Application of the Method for the Inspection of Food of Animal Origin[J].Food and Agricultural immunology，2000，12：115-125.

[8]王桂枝，石德石.氯霉素免疫原的合成与鉴定[J].中国兽医学报，1998，18(2)：163-167.

Rapid method for the determination of chloramphenicol in milk and powder milk by immunoaffinity column clean-up and HPLC-UV

LI Ying-guo1,3,ZHAO Xu-bo2,ZHANG Lei3,LI Xian-liang3,XI Cun-xian3, WANG Guo-min1,3,WANG Xiong4,GUO Qi4,LI Zheng-guo1
(1.College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry,Yangling,Shanxi 712100,China;3.Chongqing Engineering Research Center for Import and Export Food Safety,Chongqing 400020,China;4.Clover Technology Group Inc,Beijing 100044,China)

A simple and rapid method for determination Chloramphenicol（CAP）content in Milk and Powder Milk clean up by immunoaffinity column and determination by HPLC was developed.After extraction with ethyl acetate，the extracts of samples was loaded on the IAC column for purification and determined by HPLC.The recoveries of samples were in the range of 79.6%～108.6%,the RSD was below 10%.The limit of quantification for CAP was 0.1 ng/mL.Determination CAP content in Milk and Powder Milk clean up by immunoaffinity column was a rapid，simple and exact method.

Chloramphenicol；immunoaffinity column；HPLC；Milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0053-02

2011-01-17

重庆市科委资助项目（CSTC2009CB1012）。

李应国（1965-），男，高级兽医师，从事食品安全检测技术研究。

李正国