过量表达大叶补血草LgSOS1基因对拟南芥耐盐性的影响

周玲玲，祝建波，王爱英

（石河子大学生命科学学院，石河子832003）

过量表达大叶补血草LgSOS1基因对拟南芥耐盐性的影响

周玲玲，祝建波，王爱英

（石河子大学生命科学学院，石河子832003）

将从盐生植物大叶补血草（Limonium.gmelinii（Willd.）Kuntze）中分离的质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因Lg SOS1构建到p CAMBIA1301植物表达载体的Ca MV35S启动子下游上，转化拟南芥，获得抗潮霉素的转基因植株。对该植株的PCR和RT－PCR检测表明，Lg SOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。对转化植株的耐盐性实验结果表明：盐胁迫下转基因植株长势明显好于对照；盐分测定表明，转基因植株地上部分的Na＋积累显著低于野生型的，K＋含量则显著高于野生型的。这表明Lg SOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。

Lg SOS1基因；质膜Na＋／H＋逆向转运蛋白；拟南芥；耐盐性

土壤盐渍化问题是困扰农业生产的一大难题，土壤中高浓度的Na＋会扰乱植物正常的代谢活动，影响根细胞对K＋的吸收，进而导致细胞生长停止或死亡［1－2］。Na＋区隔化和 Na＋外排是植物降低细胞内Na＋浓度的主要方式，这一生理功能由Na＋／H＋逆向转运蛋白完成［3］。质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋 白 则 参 与 Na＋的 外 排［4－5］。Shi等［6－7］研 究 表明，拟南芥质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白At SOS1行使Na＋外排功能，并控制Na＋长距离运输。过量表达的遗传转化体或基因突变体的抗盐生理结果表明［8－9］，质膜型 Na＋／H＋逆向转运蛋白可调节植物的耐盐能力。文献［10－11］研究结果表明，水稻和小麦中的质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白也行使类似的功能。

有关盐生植物的质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白功能的报道较少［12－13］。我们从泌盐盐生植物大叶补血草中克隆了质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因Lg SOS1［14］。

本研究将Lg SOS1导入到拟南芥，获得过量表达的转基因植株，并分析了盐胁迫下转基因植株的耐盐性，这对进一步了解LgSOS1基因的功能及其与拟南芥耐盐能力之间的关系具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

选用拟南芥（Ar abidopsis thaliana）Colu mbia生态型，播种于育苗营养土∶蛭石∶珍珠岩为5∶2∶2的混合介质中，每3天浇一次自来水，温度为18～22℃。

1.1.2 质粒载体及菌种

质粒载体：PCAMBIA1301；

农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：GV3101菌株为石河子大学农业生物技术中心重点实验室提供。

1.1.3 酶及化学试剂

潮霉素溶液为Sigma公司产品，浓度为50 mg／L；卡那霉素和 Taq酶、A MV、RNAase inhibitor、Trizol试剂均购自上海生物工程公司；其它化学试剂为国产或进口分析纯。

1.1.4 仪器设备

Image Master VDS Pharmacia Biotech凝胶成像系统，Eppendorf台式冷冻离心机（德国Biofuge公司），FCP300型三恒电泳仪（北京六一仪器厂），My Cycler T M thermal cycler PCR仪器（Bio RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物的生长

拟南芥种子播种于盛满混合介质（草炭土∶蛭石∶珍珠岩＝5∶2∶2）直径7 c m的培养杯中，在16 h光照、8 h黑暗的长日照条件下培养，以促进开花。当植株长至茎高约3 c m时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长。待腋生花序长出，其下部的花已有授粉现象出现时进行转化，转化前，将已授粉的花及果荚除掉。

1.2.2 菌液制备及渗透操作

挑取鉴定好的农杆菌单克隆于20 mL含有40 mg／L利福平、50 mg／L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃250 r／min震荡培养至OD600为0.5左右。在转化前1天，以1∶10比例转接到50 mL含抗生素的新鲜LB液体培养基中培养过夜。第2天，当菌液OD600在1.2～1.6之间时取出，室温5 000 r／min离心15 min，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基（蔗糖5%，Sil wet L－77 200μL／L）中，OD600在0.8左右。

将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，浸泡15 min。取出植株，横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。第2天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度6－7 d。培养3－4周，待种子成熟后，收取种子。

1.2.3 转化植株的筛选

种子消毒：先用70%的乙醇浸泡2 min，再用1%NaCl O溶液涡漩洗涤15 min，无菌水漂洗5次，用0.1%的琼脂重悬浮种子，均匀分散到固体筛选培养基（1×MS，3%蔗糖，0.8%琼脂，p H 5.7，潮霉素30 mg／L）表面，放入培养室培养。大约2周后即可区分转化植株与未转化植株，将转化植株移栽到土壤中生长以收取种子。

1.2.4 转化植株的遗传分析

为得到纯合的转基因株系，转化植株要自交三代以上。

取T1代所结种子，表面消毒后播种于含30 mg／L潮霉素的固体筛选培养基上，萌发2周后统计绿苗和黄苗的分离比例（T1代分离比，单位点插入应为3∶1），将绿苗移栽到土壤中，培养至成熟，单株收取种子为T2代种子。

将T2代种子播种于含30 mg／L潮霉素的固体筛选培养基上，其中转基因植株纯合子不再发生分离，这些植株所结出的T3代种子即为转基因植株的结合系，用于耐盐性实验。

1.2.5 转基因植株的PCR和RT－PCR鉴定

提取部分转基因植株和野生型拟南芥的基因组总DNA，分别用 P1（CCTTAGAGGCGTTTGGTGAT）和 P2（AAAATAAGCAACATGATATGGAAGA）这对基因特异性引物进行PCR扩增，并以质粒CA MBIA1301－LgSOS1作阳性对照。

为了检测转化植株中LgSOS1基因是否表达，进行了RT－PCR检测。

其检测过程主要如下：采用Trizol RNA提取试剂提取一个转基因的纯系和野生型拟南芥的RNA，分别取10μL RNA，2.0μL Oligo d T，70℃5～10 min，冰浴5 min，再加入4μL 5×RT buffer，1.0μL d NTP （10 mmol／L），2.0μL Mg Cl2，0.5 μL RNase Inhibitor，0.5μL A MV 反转录酶，反应体积20μL，37℃1 h；70℃10 min。以反转录产物作为模板，利用P1、P2引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统照相。

1.2.6 盐胁迫处理

将转基因植株和野生型的种子直接播种于混合介质中，用Hoagland营养液定期浇灌。每组3个重复，每个重复包含5棵植株，于8 h光照、16 h黑暗的短日照条件下培养，以促进其营养生长。

培养28 d后，分别用0、100、150、200 mmol／L Na Cl处理。Na Cl的浓度逐渐增加，每隔一天处理一次，每次处理增加50 mmol／L，待一起达到处理终浓度后，隔一天再继续用终浓度处理7 d，对照浇灌Hoagland营养液。

观察植株的生长情况，分别取其地上部和根用于干、鲜重及离子含量的测定。

1.2.7 干、鲜重的测量

收取整株植株，用蒸馏水和去离子水将其冲洗干净，用吸水纸吸干其表面水分，并将其小心分成根和地上部分，测量鲜重。之后放入烘箱中，120℃烘烤30 min，再在80℃烘烤48 h至恒重，称量干重。

1.2.8 Na＋、K＋离子含量的测定

将上述烘干至恒重的干材料碾磨成粉末，取一定量的粉末，用8 mL 65%浓硝酸和3 mL 30%双氧水消解样品，过滤后定容至50 mL，取部分样品溶液用i CAP等离子体发射光谱仪测定K＋、Na＋含量。

2 结果与分析

2.1 转基因拟南芥的筛选及遗传分析

将转基因拟南芥T0、T1、T2、T3代种子在含30 mg／L潮霉素的MS培养基上筛选，得到转Lg SOS1植株，对其进行了分子鉴定和耐盐性分析。

2.2 转基因植株的PCR鉴定

以野生型拟南芥的DNA作对照，用Lg SOS1特异性引物P1和P2进行PCR扩增分析，结果如图1所示。

由图1可知：现转化植株中都可以扩增出大小约为1800 bp左右的目的条带，与预期的片段大小相吻合，而对照植株没有出现相应的扩增条带，这表明目的基因的确已经整合到拟南芥的基因组中。

2.3 转基因植株的RT－PCR鉴定

提取经PCR检测为阳性的转化植株及对照植株的总RNA，进一步作RT－PCR鉴定，转化植株中Lg SOS1基因的表达情况见图2。

图2显示：转化植株中Lg SOS1基因已经正常转录，野生型拟南芥没有出现相应的扩增条带，说明在转化植株中Lg SOS1基因已在转录水平上得到了表达。

图1 转LgSOS1植株的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants

图2 转LgSOS1植株的RT－PCR鉴定Fig.2 RT－PCR identification of LgSOS1 in wild type and transgenic plants

2.4 转基因植株的耐盐性分析

2.4.1 转基因植株在不同盐胁迫处理条件下的生长情况

分别用不同浓度的Na Cl处理野生型和转基因植株，其生长情况如图3所示。

由图3可见：转基因植株在0 mmol／L Na Cl中的生长与野生型植株没有明显差异，说明外源基因的插入和表达没有影响植物正常的生长。在不同浓度NaCl处理下，野生型植株和转基因植株的生长都受到抑制，但转基因植株的长势明显好于野生型。

图3 野生型植株和转基因植株在0，100，150，200 mmol／L Na Cl处理后的生长比较Fig.3 Comparing the growth of wild type plants and transgenic plants with 0，100，150，200 mmol／L Na Cl treat ment

2.4.2 盐处理对转基因植株和野生型植株鲜重和干重的影响

结果见图4。

由图4可知：在盐胁迫下，转基因植株地上部分和根的鲜重以及干重与野生型植株一样均下降，当NaCl浓度达150～200 mmol／L时，转基因植株地上部分鲜重显著高于野生型，而根的鲜重与对照差异未达到显著水平；在同样NaCl浓度下，转基因植株地上部分干重与对照差异未达到显著水平，但根的干重却显著高于对照（P＜0.05）。

图4 盐处理对转基因植株与野生型植株鲜重和干重的影响Fig.4 Effect of Na Cl treatment on the fresh weight and dry weight of transgenic plants and wild plants

2.4.3 盐处理对转基因植株与野生型植株Na＋、K＋含量的影响

结果见图5。

图5显示：与0 mmol／L Na Cl处理相比较，在不同浓度NaCl处理条件下，野生型和转基因植株地上部分的Na＋含量均有所增加。在100 mmol／L Na Cl条件下，与野生型对照相比，差异不明显；在150～200 mmol／L Na Cl条件下，转基因植株中Na＋含量显著低于野生型（P＜0.05），而野生型和转基因植株的K＋含量均有所减少。在不同浓度NaCl处理条件下，转基因植株地上部分的K＋含量与对照的差异达到显著和极显著水平（200 mmol／L）。

图5 盐处理对转基因植株与野生型植株Na＋、K＋含量的影响Fig.5 The Na＋ （A）、K＋ （B）contents of wild type plants and the transgenic plants under different concentration of NaCl treatment

3 讨论

高等植物的排Na＋机制主要与质膜Na＋／H＋逆向转运蛋白有关［15］。SOD2过量表达的拟南芥在盐胁迫下降低细胞内Na＋含量，并显著增强转基因植物的耐盐性［16］。Hamada A等从蓝藻中克隆了编码质膜Na＋／H＋逆向转运蛋白基因Syn Nhap，明确其在Na＋运输中起重要作用［17］。王姝杰等将蓝藻质膜Na＋／H＋逆向转运蛋白基因Nhap转入烟草，F1代转基因烟草的耐盐性得到了显著的提高［18］。

本研究将大叶补血草SOS1基因转入到拟南芥中进行过量表达后，Na Cl胁迫下转基因植株的长势好于野生型，并且转基因植株的鲜重、干重均高于野生型，说明盐胁迫下转基因植株有较强的耐盐表型，保持了良好的长势。另外，Na＋和K＋含量分析表明，150～200 mmol／L Na Cl条件下转基因植株地上部分Na＋含量显著低于野生型（P＜0.05），说明在盐胁迫下SOS1将Na＋转运出细胞，与植物的耐盐性直接相关。

尽管转基因植株和野生型的K＋含量均明显下降，但转基因植株K＋含量下降幅度却显著低于野生型。这可能是野生型植株细胞中过多的Na＋干扰了细胞对K＋的营养吸收，而转基因植株中可能通过催化Na＋／H＋逆向转运蛋白的跨膜运输将Na＋排出细胞外，从而维持细胞内低钠高钾的生理环境，发挥了该基因的耐盐性。在200 mmol／L NaCl处理条件下，1周后有部分野生型植株出现白化及死亡现象，可能是因为细胞中Na＋积累过多，引起了次级氧化胁迫，对植物体造成了过多的伤害，从而引起植株白化死亡。

本研究结果表明：过量表达Lg SOS1基因的拟南芥比野生型具有较强的耐盐能力，表明Lg SOS1在盐胁迫下参与了转基因植株Na＋的外排。Na＋／H＋逆向转运蛋白在耐盐中具有重要作用，随着编码Na＋／H＋逆向转运蛋白基因的发现及对其作用机制了解的加深，人们将进一步认识Na＋／H＋逆向转运蛋白功能特征及其信号传导的调节途径，有望在作物耐盐的研究方面取得重要突破，在实际生产和应用方面真正做出贡献。

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Influence on Salt Tolerance of Arabidopsis thaliana by Overexpressing LgSOS1

ZHOU Lingling，ZHU Jianbo，WANG Aiying
（College of Life Science，Shihezi University，Shihezi，832003）

The cDNAs of Lg SOS1（Gen Bank aceession No.EU780458），a plasma membrane Na＋／H＋antiporter gene Lg SOS1 separated from halophyte Limonium gmelinii （Wildl.）Kuntze，were inserted into plant vector pCA MBIA1301.Arabidopsis thaliana wild－type（WT）plants were trans for med with Agrobaterium tumefaciens containing the resultant vectors under the control of Ca MV 35S promoter，and hygro mycin－resistant plants were obtained.PCR analysis indicated that Lg SOS1 gene was integrated into the genome of Arabidopsis.RT－PCR analysis revealed that transgenic plants over－expressed the Lg SOS1 in the transcript levels.Salt stress assay showed that the transgenic plants grew more vigorously than wild－type plants.It was implied by salt contents measure analysis that，compared with WT Plants，Na＋accumulation was remarkably lower and the K＋level was obviously higher in transgenic plants under severe salt stress（150～200 mol／L NaCl）.These results showed that Lg－SOS1－overexpression improved salt tolerance of Arabidopsis transgenic plants.

Lg SOS1 gene；plasma membrane Na＋／H＋antiporter；Arabidopsis thaliana；salt tolerance

TB332

A

1007－7383（2011）06－0731－06

2011－08－23

国家转基因专项（2011ZX080052004），石河子大学高层次人才启动项目（RCZX200903）

周玲玲（1966－），女，副教授，从事植物基因工程研究；e－mail：Linglingzh＠shzu.edu.cn。