新磺棕小儿止咳合剂微生物限度检查方法的研究

陈德坚，黄春新，陈 萍，王 芳，林 蓉

（海南省人民医院药学部，海南 海口 570311）

新磺棕小儿止咳合剂是医院的生产制剂，处方主要成分有磺胺甲噁唑、甲氧苄胺嘧啶、复方甘草合剂等。临床上用于消炎、化痰、止咳，是儿科的常用制剂。根据2005年版《中国药典》要求，具有抑菌活性的供试品，应消除供试品的抑菌活性后再依法检查。本实验通过中和法和薄膜过滤法消除供试品的抑菌活性后，用5株代表菌做微生物计数的菌回收率试验及控制菌检出率测定，探讨该方法的可行性。现报道如下：

1 材料与仪器

1.1 药品 新磺棕小儿止咳合剂（规格：60ml/瓶，批号：20090102，20090106，20090109），由海南省人民医院制剂中心配制。

1.2 培养基、菌种及来源 培养基：营养琼脂，批号：0611287；玫瑰红钠琼脂，批号：0705116；胆盐乳糖培养基，批号：0701100，由北京三药科技开发公司提供；MUG培养基，批号：0701036，由北京牛牛基因技术有限公司提供。阳性对照菌：大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus）［CMCC（B）26003］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉CMCC（F）98003，由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 仪器 DSX—3型高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；PYX—250S—A型生化培养箱（广东韶关科力实验仪器有限公司）；净化工作台（上海汇龙仪表电子有限公司）；PYX—250M—A霉菌培养箱（广东韶关科力实验仪器有限公司）；HTY反复使用过滤器（杭州高得医疗器械有限公司）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

2.1.1 取经37℃培养 18-24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物各1ml，加9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至10-6，细菌数约为50-100cfu，做活菌计数备用。

2.1.2 取经25℃培养 18-24h的白色念珠菌培养物1ml，加9ml灭菌生理盐水，10倍稀释至10-5，细菌数约为50-100cfu，做活菌计数备用。

2.1.3 取经25℃培养 1周的黑曲霉斜面培养物加3-5ml灭菌生理盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液1ml，加入灭菌生理盐水9ml，10倍稀释至10-4，菌数约为50-100cfu，做活菌计数备用。

2.1.4 供试品溶液的制备 本品放置5min后取上清液10ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨稀释液至100ml，作为1∶10的供试液。

2.2 抑菌性试验［2］用需氧菌、厌氧菌培养基6管及真菌培养基4管分别接种规定量（50-100cfu）的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各两管，均在规定的温度下培养7d。结果见表1。

表1 抑菌性试验结果Table 1 The results of antibacterial test

从表1结果可知，含供试品的培养管与未加供试品的培养管比较，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌不生长；白色念珠菌、黑曲霉菌能生长。说明该供试品对细菌有很强的抑菌作用，但对霉菌、酵母菌无抑菌作用。

2.3 细菌数检查方法的研究

2.3.1 试验组 取1∶10的供试液1ml，薄膜过滤，以0.1％蛋白胨水溶液为冲洗液冲洗，每次100ml，共制备3组，每组在最后一次冲洗液中加入1％对氨基苯甲酸溶液10ml，反应30min，然后分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌液各1ml，过滤后取出滤膜，分别贴于营养平皿中于30-35℃培养。结果见表2。

2.3.2 菌液组 取试验菌1ml，采用平皿法，每种试验菌均做两份平行试验。

2.3.3 供试品对照组 不加菌液，其他操作同试验组，测量样品本底菌数。

2.3.4 稀释剂对照组 取0.1％蛋白胨水溶液1ml，薄膜过滤，同上操作。

表2 薄膜法测定3种阳性菌回收率试验结果Tahle 2 The recovery test results using Filtration m emb ranem ethod

从表2结果可知，取1：10供试液1ml按照中和法和薄膜过滤法处理，当冲洗量为500ml并加1％对氨基苯甲酸溶液10ml时，结果人工污染大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌试验组的菌回收率均大于70％，符合中国药典2005年版验证的要求。

2.4 霉菌和酵母菌检查的研究

2.4.1 试验组 按照平皿法，取两组平皿，每组2个，分别加入1∶10供试液1ml，然后每组分别加入白色念珠菌和黑曲霉菌各1ml，倾注20ml玫瑰红钠琼脂培养基，静置放冷后于23-28℃培养72h。结果见表3。

2.4.2 菌液组 取试验菌1ml，采用平皿法，每种试验菌均做两份平行试验。

2.4.3 供试品对照组 不加菌液，其他操作同试验组，测量样品本底菌数。

表3 霉菌和酵母菌回收率试验结果Table 3 The recovery test results of molds and saccharomycetes

从表3结果可知，取1：10供试液1ml按照平皿法进行处理，结果人工污染白色念珠菌和黑曲霉菌试验组的菌回收率均大于70％，符合中国药典2005年版验证的要求。

2.5 大肠埃希菌检查

2.5.1 取1∶10供试液1ml薄膜过滤，以0.1％的蛋白胨水溶液为冲洗液冲洗，每次100ml，最后一次冲洗液中加入1％对氨基苯甲酸溶液10ml，反应30min，滤膜取出放入100ml胆盐乳糖培养基中，制备两组，其中一组加入大肠埃希菌1ml，作为试验组，另一组加入金黄色葡萄球菌液1ml，作为阴性对照组，两组均置（36±1）℃温度培养24h。

2.5.2 取上述培养物各0.2ml接种至5ml-MUG培养基试管内，（36±1）℃培养，于5h、24h在365nm的紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。结果见表4。

表4 大肠埃希菌检查方法验证结果Table 4 Recovery rate of Escherichia coliin the validation test

从表4结果可知，采用中和法和薄膜过滤法处理，冲洗量为500ml，并在最后一次冲洗液中加入1％对氨苯甲酸溶液10ml，反应30min，试验组检出试验菌，阴性对照组未检出阴性对照菌，可满足中国药典2005年版验证要求。

3 结论

根据上述结果，新磺棕小儿止咳合剂微生物限度检查中的细菌数检查和控制细菌检查可依据中国药典微生物限度检查方法中的中和法和薄膜过滤法处理，冲洗量至少为500ml，并在最后一次冲洗液中加入1％对氨苯甲酸溶液10ml，反应30min。霉菌和酵母菌数检查可依据中国药典微生物限度检查方法中的平皿法进行。

4 讨论

4.1 具有抑菌药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于供试品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖［3］。检验时应排除其抑菌作用，使之不干扰染菌的限度检验。《中国药典》规定细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证的菌回收率应不低于70％。从上述结果可以看出，供试品对细菌生长有较强的抑制作用，采用中和法和薄膜过滤法进行阳性对照菌回收试验，菌回收率均大于70％，检测结果符合要求。

4.2 菌悬液配制过程中，每一级稀释液都应充分振摇混匀，由于菌种为特殊活性的生物，许多因素都会影响到最终菌悬液配制浓度。因此，试验时应确定相关参数（接种量、培养温度、培养时间、培养基的量）以便于更快找到所要的稀释级。制备好的原菌悬液以当天使用为宜，超过1周应重新计数［4］。另外，菌悬液配置过程中试验者应注意自我保护，防止感染。

［1］国家药典委员会.中国药典2005年版二部附录［S］.北京：化学工业出版社，2005∶93.

［2］卢文斌.冰硼散微生物限度检查方法学验证［J］.中国药房，2007，18（18）∶1 396-1 397.

［3］向 东，范 兵，李红缨.薄膜过滤法检查蜂胶牙泰喷雾剂中微生物的限度［J］.华西药学杂志，2006，21（3）∶299-300.

［4］马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册［M］.北京：科学出版社，2000∶62.