愈创木基型和紫丁香基型木素小分子的漆酶生物改性

裴继诚 刘海棠 胡惠仁 石淑兰 张鑫璐

（天津科技大学天津市制浆造纸重点实验室，天津，300457）

白水中的溶解和胶体物质（dissolved and colloidal substances，DCS）的积累对纸机运行和产品质量产生不良影响。DCS物质主要来自木材的某些组分，如半纤维素、果胶物质、亲脂性抽出物（木材树脂）、木聚糖、木素降解产物等及造纸添加助剂，如涂布黏合剂、残余脱墨剂、漂白剂、助留助滤剂等［1-3］。WagbergL.等［4］对TMP的白水进行了分析，结果表明，DCS中60％为碳水化合物，30％为木素类物质，10％为抽出物。

对DCS的控制方法主要有化学控制法、工艺控制法、生物控制法。生物控制法是20世纪90年代才发展起来的一种新的控制方法。

对于用漆酶处理造纸废水中的木素类物质的研究报道很多。漆酶处理木材剥皮废水，可去除90％以上的鞣酸类、酚类化合物，86％的氯代酚，99％的氯代愈创木酚和80％的氯代香草醛，92％的氯代儿茶酚［5］。白腐菌处理含有高浓芳香类化合物废水能显著降低废水颜色和COD含量［6］。Tram etes（Coriolus）versicolor处理漂白废水可使E段废水脱色60％；Pratima Bajpal［7］研究表明，降解后的木素小分子单独用漆酶处理会重新聚合。

目前的研究都是用漆酶直接处理废水，但因为废水中的成分多且复杂，很难确定漆酶对废水中某种类型的木素的作用机理，因此研究废水中特定木素的漆酶生物改性是必要的。

针叶木和阔叶木木素中都含有大量的愈创木基，针叶木中愈创木基丙烷含量80％～90％，阔叶木和草类原料中还含有大量的紫丁香基丙烷结构单元［8］。

本实验选取松柏醇作为一种愈创木基型木素小分子模型物，紫丁香醇作为一种紫丁香基型木素小分子模型物，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）、凝胶渗透色谱、红外光谱和颗粒电荷测定仪（PCD）等测试手段，进一步探讨了漆酶对木素生物改性的机理，为漆酶在处理富含木素酚类、氯酚类废水的应用方面提供理论依据。

1 实验

1.1 实验原料

漆酶由诺维信公司提供，商品号NOVOZY ME 51003，酶活800U/mL；松柏醇、紫丁香醇，购于Sigma-Aldrich；1-甲基咪唑，购于Sigma公司；乙酸酐、丙酮，购于天津市化学试剂二厂；聚二烯丙基二甲基氯化铵（polydi methyl diallyl ammonium chloride），实验室配制。

1.2 实验仪器

4000MS型气相色谱-质谱仪（GC-MS），美国瓦里安公司生产；515型凝胶渗透色谱仪，Waters410示差检测器，美国Waters公司；VECTOR 22傅里叶变换红外光谱仪，德国布鲁克仪器公司生产；PCD-03颗粒电荷测定仪，德国Mütek公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 漆酶处理

用少量丙酮分别溶解松柏醇、紫丁香醇于烧杯中，加入pH值4.5的NH4Ac-HAc缓冲溶液，配成质量浓度为0.48g/L的溶液，加入漆酶，酶用量16U/mL，通氧，45℃恒温水浴中处理2h。

1.3.2 GC-MS测定

（1）衍生化处理

松柏醇、紫丁香醇、松柏醇漆酶处理样及紫丁香醇漆酶处理样，分别加入1-甲基咪唑2mL和乙酸酐20mL进行乙酰化，然后用正己烷10、5、5mL连续萃取［9］，正己烷溶液进行GC-MS检测，反应后的溶液弃去。

（2）GC-MS分析条件

气相条件：DB-1毛细管色谱柱（0.10μm×0.25mm×30m）；测试过程：起始温度60℃，保持1min。升温程序：10℃/min，升至320℃保持3min。进样口温度320℃。采用高纯氦气作为载体，流量为1mL/min，分流比为5。

质谱条件：传输线温度280℃，离子阱温度220℃。扫描方式：全扫描，扫描范围：50～1000amu（原子质量单位，1amu=1.66×10-27kg）。电离方式：EI（电子轰击），电子轰击电压为69.9eV，离子源的温度为150℃，质谱增益为254，发射电压1388V，质谱检索谱库为NIST2002，检索物质的匹配度均在95％以上。

1.3.3 凝胶渗透色谱测定

（1）样品处理

新配制松柏醇、紫丁香醇溶液，经漆酶处理（条件同1.3.1），漆酶处理后的溶液有明显沉淀，用0.45μm的微滤膜过滤沉淀并洗涤。所得沉淀产物风干。风干样置于P2O5真空干燥器中，待质量恒定后进行测定。

（2）测试条件

色谱柱：Ultrastyragel 103A，柱温40℃，流动相四氢呋喃，流速1.0mL/min；聚苯乙烯为标样，相对分子质量分别为28500、10100、3250和1320。

1.3.4 红外光谱测试

将漆酶处理产生的沉淀进行溴化钾压片，扫描范围：370～4000cm-1，分辨率4cm-1，扫描16次，环境气体为空气。

1.3.5 阳离子需求量的测定

采用颗粒电荷测定仪（PCD）来测定松柏醇溶液（配制条件见1.3.1）、松柏醇漆酶处理液、紫丁香醇溶液（配制条件见1.3.1）、紫丁香醇漆酶处理液和缓冲液空白样的阳离子需求量，样品用去离子水稀释100倍进行测定。阳离子标准溶液为0.0001mol/L聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液。

阳离子需求量的计算公式如下：

式中，q为阳离子需求量，mmol/L；V1为消耗标准滴定液的体积，mL；V2为样品的体积，取样10mL；C为标准滴定液的浓度，mmol/L，C=0.1mmol/L。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS测定

GC-MS技术可提供保留时间和质核比的信息，乙酰化松柏醇对照样的质谱图和标准质谱库对照图如图1所示。

图1 乙酰化松柏醇对照样的质谱图与4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯标准质谱库

从图1可看出，保留时间15.88min出峰物质的质谱图与标准质谱库的4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯相似度为731，图1中乙酰化松柏醇对照样特征离子峰m/z是222.1，标准谱库4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯的特征离子峰m/z是222.0，依质谱图信息可推知，乙酰化的松柏醇对照样出峰保留时间为15.88min。

乙酰化紫丁香醇对照样的质谱图和标准质谱库对照图如图2所示。

图2 乙酰化紫丁香醇的质谱图与2，6-二甲氧基甲酯标准质谱库

从图2可看出，保留时间9.99min出峰物质的质谱图与标准质谱库的2，6-二甲氧基甲酯相似度为735，乙酰化的紫丁香醇对照样特征离子峰m/z是154.1，标准质谱库中2，6-二甲氧基甲酯的特征离子峰m/z是150.0，依质谱图信息可推知，乙酰化的紫丁香醇对照样出峰保留时间为9.99min。

乙酰化松柏醇对照样和松柏醇漆酶处理样GCMS色谱总离子流色谱图如图3所示。

图3 松柏醇和松柏醇漆酶处理样GC-MS总离子流色谱图

从图3可以看出，松柏醇乙酰化后的样品中4-［3-乙酰氧基-1-烯丙基］-2-甲氧基-苯酚乙酯在15.88min出峰很明显，松柏醇漆酶处理样相应的时间内松柏醇峰消失，检测不到松柏醇单体的存在，推测松柏醇参与了反应。

乙酰化紫丁香醇对照样和紫丁香醇漆酶处理样GC-MS色谱总离子流色谱图见图4。

图4 乙酰化紫丁香醇对照样和紫丁香醇漆酶处理样GC-MS总离子流色谱图

从图4可以看出，紫丁香醇乙酰化后的样品中2，6-二甲氧基甲酯在9.99min出峰很明显，而紫丁香醇漆酶处理样在相应的时间内，紫丁香醇色谱峰消失，检测不到紫丁香醇单体的存在，推测紫丁香醇参与了反应。

2.2 凝胶渗透色谱分析

GC-MS分析漆酶处理后的松柏醇和紫丁香醇试样，没有检测到松柏醇和紫丁香醇单体，却发现反应过程有沉淀析出，推测在漆酶处理过程中松柏醇和紫丁香醇发生了自由基缩合反应，分子质量增大。CarstenMai等人［10］研究表明，漆酶可以催化木素结构中的酚羟基生成苯氧自由基（Phenoxy），苯氧自由基之间可以发生共价连接，从而使木素之间发生共聚。为此，采用凝胶渗透色谱对漆酶处理产物的分子质量进行测定，结果如表1所示。

表1 松柏醇漆酶处理样的分子质量及多分散性

松柏醇单体相对分子质量为180.2，从表1可看出，漆酶处理后Mn为1658，Mw为1886；紫丁香醇单体相对分子质量为154.2，漆酶处理后Mn为698，Mw为745，说明松柏醇、紫丁香醇经漆酶生物改性，分子之间发生了一定的聚合反应；依多分散性可看出，产物接近单分散样品，分子质量分布较集中。

2.3 红外光谱分析

松柏醇与松柏醇漆酶处理样红外光谱图如图5所示。

图5 松柏醇及松柏醇漆酶处理样的红外光谱图

从图5可看出，松柏醇在3464和3246cm-1处有酚羟基和侧链上的O—H伸缩振动吸收峰，而松柏醇漆酶处理样的2个O—H吸收峰却不见了。松柏醇漆酶处理后2855和2939cm-1处的—CH2伸缩吸收峰消失，推测松柏醇的γ碳有可能与它连着的羟基一同参与反应。松柏醇漆酶处理后1452cm-1处—CH3的反对称伸缩振动，1035cm-1处的甲基C—O变形振动减弱，推测有可能是甲基参与了反应，使得松柏醇以某种方式连接。松柏醇漆酶处理后802cm-1处1，2，4-三取代苯环的伸缩振动，686cm-1处RCCRH顺式伸缩振动峰都消失了，推测漆酶处理，苯环取代基可能有变，苯环侧链参与了反应。1602、1421、662、618cm-1处苯环特征吸收峰强度和峰面积的增大，表明产物分子苯环的增加。在1271cm-1处出现芳基醚伸缩振动，推测松柏醇以某种醚键方式连接。

紫丁香醇与紫丁香醇漆酶处理样的红外光谱图如图6所示。

图6 紫丁香醇及紫丁香醇漆酶处理样的红外光谱图

从图6可看出，紫丁香醇在3489和3456cm-1处有吸收峰，这是紫丁香醇苯环上的酚羟基伸缩振动；非醚化的酚羟基在1367、1239、1214cm-1处也有吸收峰，紫丁香醇漆酶处理样在3432cm-1处缔合为1个宽峰，1357cm-1处吸收峰明显减弱，1239和1214cm-1的吸收峰消失，这说明在紫丁香醇漆酶处理的过程中酚羟基发生了反应。紫丁香醇在2961、1458cm-1处甲基的反对称伸缩振动和反对称弯曲振动消失或是减弱，说明漆酶改性过程中甲基参与了反应，1029cm-1处甲氧基C—O变形振动减弱，相应的1272cm-1处芳基醚吸收强度增大，推测甲氧基被脱除。769、726、706cm-1处1，2，3-三取代苯环吸收峰消失。1615、1510cm-1处单核芳烃的CC振动以及853、825cm-1处苯环δ（C—H）面外吸收强度及峰面积显著增大，可推测苯环以某种方式连接在一起生成芳基醚，使聚合产物苯环增多，分子质量增大。

2.4 阳离子需求量测定

采用颗粒电荷测定仪来测定松柏醇、紫丁香醇漆酶处理样的阳离子需求量，进而可知溶液中的阴离子电荷量，所得结果见表2。

表2 松柏醇、松柏醇漆酶处理样、紫丁香醇、紫丁香醇漆酶处理样的阳离子需求量

从表2可看出，松柏醇经漆酶处理后，阳离子需求量从1.93mmol/L降为0.94mmol/L，紫丁香醇经漆酶处理阳离子需求量从1.52mmol/L降为0.90mmol/L，这其中缓冲液空白样的阳离子需求量为0.81mmol/L。若扣除缓冲液空白样的阳离子需求量，算出漆酶处理松柏醇阳离子需求量下降88.4％，紫丁香醇阳离子需求量下降87.4％，由此可知漆酶对松柏醇、紫丁香醇这两类木素酚类物质的去除效果明显。

3 结论

3.1 松柏醇、紫丁香醇经漆酶处理后，GC-MS检测这两种小分子相应的峰消失，说明松柏醇、紫丁香醇参与反应，分子结构发生变化，小分子单体已不存在。

3.2 凝胶渗透色谱测定松柏醇、紫丁香醇经漆酶处理后分子质量变大，进一步说明松柏醇、紫丁香醇漆酶处理过程中发生了反应，产物聚合。

3.3 红外图谱的结构分析得出，松柏醇双键以及β碳、γ碳都有可能参与了反应。松柏醇、紫丁香醇甲氧基伸缩振动消失，芳基醚吸收增强，苯环特征吸收峰的强度及面积显著增大，由此可推测松柏醇、紫丁香醇单体以某种方式连接在一起生成芳基醚，使聚合产物苯环增多。

3.4 松柏醇、紫丁香醇经漆酶处理后溶液阳离子需求量分别下降了88.4％和87.4％，说明漆酶处理使小分子木素类物质聚合而沉降，减少了废水中的阴离子垃圾，很大程度地降低了阳离子需求量，这使漆酶处理含木素类废水具有广阔的前景。

［1］Sjostrom J.Fractionation and characterization of organic substances dissolved in water during groundwood pulping of spruce［J］.Nord.Pulp Paper Res.J.，1990，5（1）：9.

［2］Seika Tay.Effect of dissolved and colloidal contaminants in newsprint machine white water on water surface tension and paper physical properties［J］.Tappi Journal，2001，84（8）：1.

［3］Ben Y，Dorris G，Hill G，et al.Contaminant removal from deinking processwater，Part I：Mill benchmarking［J］.Pulp＆Paper Canada，2003，104（1）：42.

［4］Wagberg L，Asell I.The action of cationic polyelectrolytes used for the fixation of dissolved and colloidal substances［J］.Nordic Pulp Paper Res J，1991（6）：127.

［5］Leonowicz A，Edgehill R U，Bollag J-M.The effect of pH on the transformation of syringic and vanillic acids by the laccases of Rhizoctonia praticola and Trametes versicolor［J］.Arch Microbiol，1984，137：89.

［6］Sannia Giovanni，Giardina Paola，Palmieri Gianna，et al.Waste water treatmentmethod usingmicroorganisms：WO0212136［P］.2002-02-14.

［7］Pratima Bajpal.Application of enzymes in the pulp and paper industry［J］.Biotechnol.Prog.，1999，15：147.

［8］Johan Gullichsen，Hannu Paulapuro.Forest Products Chemistry（Book 3）［M］//PAPERMAKI NG SCIENCE AND TECHNOLOGY.Finnish Paper Engineer’sAssociation and Tappi，2001.

［9］石淑兰，何福望.制浆造纸分析与检验［M］.北京：中国轻工业出版社，2003.

［10］CarstenMai，W iebke Schor manna，Alois Hütter manna.The effect of ions on the enzymatically induced synthesisof lignin graft copolymers.Enzyme andMicrobial Technology，2001，28（4/5）：460.