天然产物中二氢槲皮素分离纯化及发展趋势

徐红艳包怡红

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学农学院，吉林 延吉 133400）

天然产物中二氢槲皮素分离纯化及发展趋势

徐红艳1，2包怡红1

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学农学院，吉林 延吉 133400）

二氢槲皮素属黄酮醇类化合物，因具有广泛的生物功能和多种用途，从天然产物中获取二氢槲皮素的研究日益受到人们的关注。文章对其分离纯化方法进行介绍，主要有有机溶剂萃取法、沉淀分离法、微波辅助提取法、超声－微波交替法、结晶与重结晶法、色谱法等等。通过各种方法的比较，分析概括各种方法的优缺点，并对今后研究方法的应用方向进行展望。

二氢槲皮素；分离纯化；发展趋势

二氢槲皮素（dihydroquercetin）又名紫杉叶素、黄杉素、花旗松素（分子结构式见图1），为无色针状结晶，易溶于乙醇、乙酸、沸水，稍溶于冷水，几乎不溶于苯，属二氢黄酮醇类化合物，是P族维生素，是一种应用广泛的生物活性物质和有效的抗氧化剂［1－2］，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤、保护细胞内酶等作用。有试验［3］证明，二氢槲皮素能显著减轻大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌损伤并缩小心肌梗死面积，保护心功能；增加机体内源性清除氧自由基的能力，抑制心肌缺血再灌注中活性氧自由基产生及其产生的脂质过氧化反应。

图1 二氢槲皮素的分子结构式Figure 1 Molecular structural formula of dihydroquercetin

在食品业，二氢槲皮素可作为食品生物活性添加剂，加入到植物油、动物脂肪、干奶粉以及含脂肪的糖果、点心食品中以延长食品的有效期，添加到酒类中可使酒的性能得到改善。在制药业，可利用二氢槲皮素保持血管壁良好柔韧性，提高红细胞活性，抑制血小板之间的粘连等功能生产用于治疗缺血性心脏病、保肝护肝、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等药物。在农业，可用二氢槲皮素为主要原料生产植物生长调节剂，以增加植物的产量，提高抗病能力。在工业，二氢槲皮素还可作为火箭原料的抗震剂和稳定剂，发电机油、工业油和碳氢化合物原料的稳定剂以及颜料和油漆的抗氧化剂等等。由于二氢槲皮素的多种生物功能和广泛的应用前景，从天然产物中分离纯化二氢槲皮素的研究日益受到学者的重视。

二氢槲皮素的分离纯化是指在天然产物中获取二氢槲皮素的过程，这一过程主要是二氢槲皮素与其他非黄酮类化合物的分离以及黄酮类化合物之间的单体分离。一般包括提取、分离、纯化、纯度鉴定以及在天然产物中的含量测定。目前，天然二氢槲皮素主要是从落叶松中分离纯化［4－7］所得，也有从刺玫蔷薇茎中分离纯化所得的报道［8－9］。所采用的分离纯化方法主要有有机溶剂萃取法、沉淀分离法、微波辅助提取法、超声－微波交替法、结晶与重结晶法、硅胶色谱法、凝胶色谱法、聚酰胺色谱法、高速逆流色谱法、高效液相色谱法等。

1 二氢槲皮素的初步分离纯化方法

1.1 有机溶剂萃取法

有机溶剂萃取法是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的的方法。影响分离效果的主要因素包括：萃取剂、被萃取的物质在萃取剂与原样品溶液两相之间的平衡关系、在萃取过程中两相之间的接触情况。在被萃取物质一定的条件下，主要决定于萃取剂的选择和萃取次数［10］。有机溶剂萃取法是天然有机化合物分离中常用的分离方法。目前，用于提取分离二氢槲皮素的有机溶剂主要是乙酸乙酯。王萍等［8－9］对刺玫蔷薇茎的浸提液真空抽滤，加HCl或H2SO4水解，用乙酸乙脂萃取，再减压浓缩，离心，分离得到二氢槲皮素粗品。

1.2 沉淀分离法

沉淀分离法是指在样品溶液中加入某些溶剂或沉淀剂，通过化学反应或改变溶液的pH值、温度等，使分离物质以固相物质形式沉淀析出的一种方法［10］。能否将物质从溶液中析出，需要选择适当的沉淀剂和沉淀条件。而对于一些活性物质的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性及化学结构是否破坏，对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离，还必须考虑残留物对人体的危害。金建忠等［4－5］在落叶松粗提液中加入沉淀剂A并用饱和碳酸钠溶液调节pH值到6，然后离心分离，沉淀用1mol/L HCl溶液转溶，再经乙酸乙酯萃取，结晶得二氢槲皮素。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法是采用微波和传统的溶剂萃取法相结合从各种物质中提取化学成分的一种新的萃取方法。微波萃取是利用微波照射物质，高频电磁波穿透萃取媒质，使物料细胞内的温度突然升高，连续的高温使内部压力超过细胞空间膨胀的压力，导致细胞破裂，较短时间内萃取出目标物质的方法。它根据被照射物质的结构不同，对吸收微波能力的差异进行选择性加热，因此具有选择性高、溶剂消耗少、有效成分提取率高、时间短等特点［11］，现已应用到天然产物有效成分的提取分离中，是一种全新的“绿色”萃取技术［12］。韩俊凤等［7］采用微波辅助提取法，将落叶松碎屑浸润后先进行微波处理，然后在水浴条件下加热搅拌，过滤，减压浓缩滤液。再向浸提液中加入聚酰胺，搅拌过滤，滤渣用乙酸乙酯重复洗涤，收集滤液，减压蒸馏至干，最后获得淡黄色粉末，即二氢槲皮素粗品。杨磊等［13］对超声提取法、微波提取法和加热提取法进行比较，分别采用250W超声40min，700W 微波20min和搅拌下加热（80℃回流）240min的方法从落叶松木粉中提取二氢槲皮素，结果表明在3种方法中，微波提取法提取得率最高，可达0.116%，回流提取法的累积得率可达微波提取法的95.9%，而超声提取法的累积得率仅达到微波提取法累积得率的55.2%。

1.4 超声－微波交替法

超声－微波交替法就是利用超声波法和微波法的交替作用，从各种物质中提取目标成分的一种方法。马春慧等［14］采用超声－微波交替法从落叶松中提取二氢槲皮素，得率可达0.12%，明显优于单独超声提取得率的0.034%和单独微波提取得率的0.074%，并通过扫描电子显微镜观察超声－微波交替法抽提效果最明显。

2 二氢槲皮素的高度分离纯化方法

2.1 结晶与重结晶

结晶是指物质从不是结晶状处理到结晶状；重结晶是指从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶，常用于天然有机化合物的提纯和精制。用结晶和重结晶法分离纯化有机化合物是利用要提纯分离的化合物与其他化合物在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系不同，使要提纯分离的化合物从其粗提混合物中分离出来。结晶法分离精制的关键是正确选择溶剂和结晶的条件。席丹莹等［15］将二氢槲皮素粗品用水重结晶5次以上，得到纯度为95%的二氢槲皮素。金建忠等［4－5］对二氢槲皮素初步分离液采用减压浓缩至干，用热水溶解残渣，冰箱冷冻（5℃）结晶，后快速离心，分离得到二氢槲皮素。

2.2 硅胶色谱

硅胶色谱是用硅胶作为固定相的液－固色谱分离法，能用于非极性化合物和用于极性化合物的分离，适用范围广，由于其价格低廉，可选择的溶剂种类多，样品损耗少，分离后溶剂易于除去，并且分离速度快，因此是常用的天然产物分离手段。谢周涛等［16］采用硅胶色谱分离和光谱分析研究水红花子的化学成分，最后分离出7种化合物，其中一种是二氢槲皮素。王岩等［17］采用色谱和光谱分析法对显齿蛇葡萄的化学成分进行了研究，经分离和鉴定，得到二氢槲皮素等7种化合物，并且二氢槲皮素是首次从蛇葡萄属植物中分得。郑国华等［18］用色谱和光谱分析法在霉茶中提取分离出二氢槲皮素等7种化合物。

2.3 聚酰胺色谱

聚酰胺色谱法是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键结合而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。由于二氢槲皮素中含有较多的酚羟基，所以聚酰胺色谱对其具有强吸附力。甘春丽等［19］采用聚酰胺柱色谱法，乙醇－水梯度洗脱，成功将槲皮素和二氢槲皮素的混合物进行了分离。王岩等［17］采用聚酰胺色谱法分离显齿蛇葡萄的化学成分。对显齿蛇葡萄粗提浸膏干法上样，反复进行100～200目聚酰胺柱层析，以乙醇－水溶剂系统梯度洗脱，得二氢槲皮素。

2.4 凝胶色谱

凝胶色谱是20世纪60年代发展起来的一种分离技术，使用的固定相是凝胶，凝胶是具有许多孔隙的网状结构的固体，有分子筛的性质。凝胶可根据混合物中各组分相对分子质量大小的不同对其进行分离，因此非常适合用于从样品中除去高相对分子质量成分及聚合物。当混合物通过凝胶相时，大分子不被迟滞而随溶液走在前面，小分子则由于向孔隙内扩散或移动得到滞留，所以落后于大分子而得到分离［20］。凝胶色谱不仅可作为一种有效的初步分离手段，还可被用于最后的分离，以除去最后微量的杂质。王岩等［17］在分离显齿蛇葡萄的化学成分研究中，洗脱液最后经SephadexLH－20柱层析纯化，分离得到二氢槲皮素。

2.5 高效液相色谱

高效液相色谱（HPLC）是在液相色谱中采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高硅泵输送流动相，全部工作通过仪器完成而实现对物质进行分离分析的方法。高效液相色谱法具有分离效率高、产品纯度高、操作方便等优点［21］。即可用于定性分析，也可用于定量分析。对天然产物中二氢槲皮素的含量，常用高效液相色谱进行测定。王宇等［22］采用RPHPLC法测定落叶松中二氢槲皮素的含量，采用色谱柱HypersilODS－C18，流动相为甲醇－水－冰醋酸（40∶59∶1），柱温28℃。结果显示，在此条件下二氢槲皮素与其他组分得到良好的分离，线性范围0.02～0.2μg/μL，（r＝0.999 8），精密度RSD为0.96%（n＝5），平均回收率为100.4%。樊铁波等［23－25］采用HPLC法测松针中二氢槲皮素的含量、不同地区水红花子中花旗松素含量和红蓼不同提取部位花旗松素的含量，表明HPLC法可用于分离测定天然产物中二氢槲皮素的含量。

2.6 高速逆流色谱

高速逆流色谱（HSCCC）是一种不用固态支撑体的液－液分配色谱，分离原理是基于某一样品在两个互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中的各个组分在通过两溶剂的过程中按不同的分配系数得以分离［20］。与液－固色谱法相比，可避免样品的不可逆吸附现象，并可避免样品因与某些固体固定相相互作用发生的破坏，对样品的预处理要求也比较低，具有快速、高效的优点［26］；与高效液相色谱相比具有上样量更多的优势［27］。高速逆流色谱分离时，溶剂系统是最重要的因素。另外，主机转速、流动相流速和样品浓度等也是具有一定影响的因素［28］。Yun Wei等［29］采用溶剂系统为乙酸乙酯－甲醇－水 （25∶1∶25，V/V），从400mg中草药仙鹤草粗提物中分离出11mg花旗松素－3－糖苷和槲皮素－3－半乳糖苷，分离纯度达到96%，最后采用质谱、核磁共振氢谱和13C－NMR谱进行了结构鉴定。

3 各种分离纯化方法的比较

将二氢槲皮素的分离纯化方法进行综合比较，见表1。由表1可见，色谱技术由于分离速度快，分离纯度高等优点，特别是高速逆流色谱，是今后分离纯化二氢槲皮素优选的方法。

表1 分离纯化二氢槲皮素的方法比较Table 1 Comparison of methods of isolation and purification on dihydroquercetin

4 展望

在从天然产物中分离纯化二氢槲皮素过程中，往往需要采用几种不同的分离纯化方法，进行多次有针对性的分离纯化，从而实现从粗提到分离纯化及纯度鉴定的目的。随着二氢槲皮素分离纯化技术的发展，大大加快了从天然产物中获取二氢槲皮素的发展进程，必将不断提高其得率和分离纯度，以满足二氢槲皮素在食品和医药等领域的需求。

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Present status and developing trend of isolation and purification on dihydroquercetin from natural products

XU Hong－yan1，2BAO Yi－hong1

（1.Forestry College of Northeast Forestry University，Haerbin，Heilongjiang150040，China；2.Agricultural College of Yanbian University，yanji，Jilin133000，China）

Dihydroquercetin is a flavonol，it has a lot of biological function and use，so studies on dihydroquercetin from natural products have been followed with interest.This paper introduced the methods of isolation and purification on dihydroquercetin from natural products.There are organic solvent extraction，doposit isolation，microwave－assisted extraction，ultrasonic wave by turn microwave extraction，crystallization and repeating crystallization，chromatography etc.Through contrasting these methods，analyzed and summarized advantages and disadvantages of every method，and looked forward applicative direction of research methods in the future.

dihydroquercetin；isolation and purification；developing trend

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.049

徐红艳（1975－），女，延边大学讲师，东北林业大学在读博士。E－mail：xuhongyan0291＠hotmail.com

包怡红

2010－06－11