生物芯片技术及其在食品营养与安全检测中的应用

唐亚丽卢立新赵 伟

（1.江南大学机械工程学院包装工程系，江苏 无锡 214122；2.中国包装总公司食品包装技术与安全重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

生物芯片技术及其在食品营养与安全检测中的应用

唐亚丽1，2卢立新1，2赵 伟3

（1.江南大学机械工程学院包装工程系，江苏 无锡 214122；2.中国包装总公司食品包装技术与安全重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

从食品营养与安全角度出发，介绍生物芯片的原理及分类，着重讨论此类技术在食源性微生物检测、有害物质分析及食品营养与疾病机理方面的研究，旨在为食品工业与高新检测技术的进一步结合提供理论帮助。

生物芯片；营养；食品安全

生物芯片技术是20世纪90年代初期发展起来的一门新兴技术。通过微加工技术制作的生物芯片，可以把成千上万乃至几十万个生命信息集成在一个很小的芯片上，达到对基因、抗原和活体细胞等进行分析和检测的目的。用这些生物芯片制作的各种生化分析仪和传统仪器相比较具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等优点。因此，生物芯片技术得到各国学术界和工业界的关注，广泛应用于生命科学、医药卫生、农业食品等领域。

1 生物芯片的原理及分类

1.1 生物芯片的原理

生物芯片的实质是通过微加工技术在面积不大的基片表面上有序的点阵排列一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子。结合或反应在相同条件下进行。反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术纪录。通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息（图1）。

图1 生物芯片分析步骤Figure 1 The analytical procedure of biochips

1.2 生物芯片的分类

生物芯片技术主要包括微流路芯片、阵列生物芯片和微缩芯片实验室三大类。此外，根据芯片上的探针又可分为以下几类：基因芯片（gene chip）、组织芯片、蛋白质芯片、细胞芯片。

1.2.1 微流路芯片 IC生物芯片是基于CMOS而设计的。其检测元件由光电晶体管和光电二极管以4×4或是10×10阵列组成。微流路生物芯片是在IC芯片的基础上以光刻或化学湿腐蚀技术制备的［1］。微流路芯片的微缩使毛细管电泳进样、分离和检测的集成成为可能，分析速度大大提高，样品与溶剂的消耗大大减少，检测效率也得以提高。

1.2.2 阵列生物芯片 阵列生物芯片主要是基于杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）技术的检测方法。将一组挂核苷酸探针固定在硅、玻璃等基片表面，组成一个二维阵列。在这个阵列上每一个探针都有其特定的坐标位置，只要合理地设计阵列，与待测的DNA进行杂交反应，利用杂冲洗去非特异性的DNA，然后检测杂交信号，再通过一定的算法就可以得到待测的DNA序列［2］。

1.2.3 缩微芯片实验室 缩微芯片实验室是集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体，实现生化分析全过程，是生物芯片发展的最高阶段［3］。

1.2.4 基因芯片 基因芯片又称 DNA微阵列（DNA microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列形成的探针阵列。基因芯片把大量已知序列探针集成在同一基片上，经过标记的若干靶核苷酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交，便可根据碱基互补匹配原理确定靶基因的序列。通过处理和分析基因芯片杂交检测图像，可以对生物细胞或组织中的大量基因信息进行分析。Hardy等［4］利用基因芯片技术对缺失型DMD患者进行了检测。将基因芯片技术与传统PCR技术作对照，显示出明显的灵敏、高效等优势。

1.2.5 组织芯片 生物芯片技术在病理组织和组织化学方面的应用，可以用组织芯片的出现作为代表。组织芯片是利用各种酶、核素或荧光标记的不同基因、寡核苷酸、抗体在微缩组织切片上进行杂交和标记染色，最后在显微镜下获取图像信息（或通过计算机处理所获的信息），以研究目的基因或基因产物在不同组织之间的表达差异。主要用于蛋白表达研究、抗体筛选、组织型特异性研究及小鼠模式试验；组织化学试剂盒用于组织芯片的染色。

1.2.6 蛋白质芯片 蛋白质芯片是利用抗体与抗原结合的特异性，以实现蛋白质的检测。蛋白质芯片主要应用于结合分析，激酶分析、蛋白酶分析、细胞分析。用于发展新的活性肽，肽的优化及转化，并以此来寻找新药的先导化合物。

1.2.7 细胞芯片 细胞芯片比蛋白质芯片的优越之处，在于此法不需要蛋白纯化，细胞是研究膜结合蛋白更好的对象。CDNA比蛋白更稳定，并可监测表达时间短暂的蛋白。

2 生物芯片技术在食品安全检测中的应用

2.1 食源性微生物的监测

与传统检测方法及分子生物学、免疫学方法相比，生物芯片技术特异性强，准确率高。可应用于食物中致病菌的快速诊断、转基因食品分析等，具有广阔的应用前景和较大的经济与社会效益［5］。

2.1.1 单种微生物的分析鉴定

（1）大肠杆菌：大肠杆菌是人类和大多数温血动物肠道中的正常菌群，但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起流行疾病暴发，病情严重者，可危急生命。Bruant等［5］设计了E.coli189个毒力基因和30个耐药性基因的寡核苷酸基因芯片用于E.coli致病性及其耐药性的监测，为E.coli的环境检测、流行病学和遗传变异研究提供了强有力的工具。Chandler等［6］确定免疫磁珠分离结合微阵列可检测生禽肉清洗液中的O157∶H7，其检测限达103CFU/mL。

（2）金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%。Sergeev等［7］利用基因芯片同时检测和鉴定了多个肠毒素基因，在同一个金黄色葡萄球菌菌株中最多检测到9个不同的肠毒素基因。高志贤等［8］用玻片表面分别固定兔抗SEA、SEB、SEC 3种抗体，检测葡萄球菌肠毒素（SE），检测的灵敏度为纳克每毫升（ng/mL）水平。李玉锋等［9］采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌16Sr－RNA基因的DNA片段，建立了快速鉴定食源性金黄色葡萄球菌的基因芯片技术。

（3）李斯特氏菌：李斯特氏菌4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染。Volokhov等［10］通过单管复合体扩增和基因芯片技术简便、迅速地鉴别李斯特菌属6个种的基因型。Borucki等［11］构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核细胞增生李斯特菌分离物。

（4）蜡状芽孢杆菌：蜡状芽孢杆菌细菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是典型的菌体细胞，可产生肠毒素，包括腹泻毒素和呕吐毒素。几乎所有的蜡状芽胞杆菌均可在多种食品中产生腹泻毒素。在土壤、灰尘、腐草、空气中都有此菌存在。肉类制品、奶类制品、蔬菜和水果的带菌率为20%～70%。Gabig－Ciminska等［12］采用基因芯片检测方法，4h内即可检出细菌细胞或芽孢的DNA信号。

（5）弧菌：危害中国海水养殖鱼类的主要病原是弧菌。Panicker等［13］利用多重PCR与特异基因DNA芯片耦合的方法，对海水和贝类样品的致病性弧菌（创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌）进行了检测，该方法的特异性为100%。可以保证快速、准确地检测贝类食品的致病性弧菌。金慧英等［14］选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因，设计引物和探针，并制备检测芯片，通过2次PCR扩增，制备荧光标记的靶序列，并与芯片进行杂交，研制了一种快速、特异、灵敏的检测霍乱弧菌基因芯片。

2.1.2 多种微生物的分析鉴定 利用生物芯片技术不仅可以分析单一微生物，还可以对多种微生物进行鉴定。Wilson等［15］开发出一套多病原体识别（MPID）微阵列，可准确识别18种致病性病毒、原核生物和真核生物，对炭疽杆菌的检测限低至10fg（×10－15）。陈广全等［16］研制了一种高通量检测食品中常见致病微生物的寡核普酸微阵列芯片，可鉴别金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157∶H7、霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、乙型溶血型链球菌和副溶血性弧菌。特异性良好，无交叉反应。Carl等［17］对4种细菌，即大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、空肠弯曲菌采用了基因芯片的检测方法，其检测结果不仅敏感度高于传统方法，且操作简单，重复性好，并节省了大量时间，大大提高了4种细菌诊断效率。Hong等［18］设计了基于23SrRNA的寡核苷酸芯片，可同时检测食品中的14种致病菌。陈昱等［19］建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法。赵金毅等［20］利用可视芯片技术可以准确的检出沙门氏菌属和金黄色葡萄球、小肠结核肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌3种食品中常见致病菌。

2.2 食源性病毒的检测

在动物疫病病原菌的检测方面，已开发了分别用于马毒性动脉炎病毒（EAV）、非洲马瘟病毒（AHS）、马鼻肺炎病毒（EHV－4）、马冠状病毒（ECV）和西尼罗热病毒（WNV）5种马病毒检测和犬病病毒检测的基因芯片。可将基因芯片技术用于食源性致病病毒诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒、星状病毒和脊髓灰质炎病毒的检测。

陈广全等［21］采用基因芯片方法检测贝类食品中引起人类腹泻的5种食源性致病病毒。该基因芯片具有良好的特异性，在5种病毒之间无交叉反应，其灵敏度与荧光PCR方法基本一致。杨素等［22］设计的针对于口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒的基因芯片，可同时诊断上述5种动物传染病。周琦等［23］也研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片，可对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测。

2.3 药物残留的分析

药物残留可以随着食物链进入人体，对人类的健康构成潜在的威胁。目前，多种药物残留可以通过生物芯片技术进行检测，主要包括：磺胺二甲基嘧啶、链霉素、恩诺沙星和克伦特罗，检测对象包括了鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、猪尿和牛奶等。具有前处理简单，灵敏度高，特异性好，检测速度快，检测通量高，质控体系严密等优点。

张东等［24］采用微珠芯片免疫分析法，实现了对动物源性食品中氯霉素残留有效、快速的检测。方法检测限为0.01μg/L，具有良好的灵敏度、准确度和精密度，符合快速、高通量检测氯霉素残留的要求，并为实现介观流控免疫分析提供了基础。Knecht等［25］采用间接竞争ELISA模式，建立一种可快速、自动、平行检测牛奶中10种抗生素残留的蛋白质微阵列，单个组分检测所用时间不到5min，10种组分的检测限在0.12～32μg/L之间。Zuo等［26］构建了一种可同时检测食品中3种兽药残留的小分子微阵列（small molecule microarrays，SMMs），检测时间不超过2h，待测样品检测与加标回收试验结果表明所构建的微阵列具有良好的可靠性。Belleville等［27］应用芯片技术监测小分子的农药敌草腈的代谢物2，6－二氯苯甲酰胺和阿特拉津，其最低检测限分别为1ng/L和3ng/L，试验结果明显优于ELISA和GC/MS检测方法。郭志红等［28］对猪和鸡组织样品中兽药残留等进行检测，能够同时检测各种残留，结果与使用ELISA试剂盒、HPLC法及GC－MS法得到的结果有很好的一致性。左鹏等［29］利用蛋白芯片竞争法快速准确测定动物源性食品中氯霉素、磺胺二甲嘧啶的残留量，该方法具有快速、高通量、并行性等特点，尤其适合出入境检验检疫、食品安全监管、品质控制等领域作为初筛方法应用。

2.4 真菌毒素的检测

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。Tudos等［30］将酪蛋白与脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）共轭连接制成人工抗原，固定在芯片上，再加入含有DON抗体的待检测溶液，通过SPR技术检测反应信号，从而构建了一种用于对小麦中DON进行定量分析的免疫芯片。该芯片用盐酸胍处理可反复使用500次，最佳检测范围为2.5～30ng/mL，检测结果与使用气质联用（GC－MS）检测一致。

2.5 转基因食品的检测

转基因食品（GMF）是指利用基因工程技术改变基因组成构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。转基因食品代表了当今高新农业技术的发展方向，有着非常巨大、潜在效益和市场。就目前转基因食品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺点是检测范围窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。生物芯片具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点，是转基因食品检测的方向。现已广泛应用于大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测。

Lok－Ting Lau等［31］应用 DNA 芯片及 PCR技术测定转基因大豆中的重组子DNA，证明重组DNA源于大豆基因组并不会传入非大豆基因物质。许小丹等［32］制备了检测及鉴定转基因大豆的寡核苷酸芯片。该芯片探针特异性好、灵敏度高，检测极限为0.1ng（DNA），从而消除假阴性概率，灵敏度优于凝胶电泳检测。

3 生物芯片技术在食品营养分析中的应用

3.1 营养机理的研究

基因芯片最重要的应用是研究代谢与基因调节。生理学的转化常常伴随组织学和生物化学（包括基因表达方式）的变化，基因活动的上调或下调是病理生理学及疾病的起因。资料［33］表明，某些食品具有疾病预防与控制功效，但其机理尚不清楚。生物芯片技术可用于营养机理的研究，如营养与肿瘤相关基因表达的研究［34］，营养与心脑血管疾病关系的分子学研究［35－36］等。

利用人全部基因的cDNA芯片研究在营养素缺乏、适宜和过剩等状况下的基因表达图谱，结合基因表达与蛋白质表达的结果，将为确认人体对营养素准确需要量的生物标志物奠定坚实的基础，并为制定更准确、合理的膳食参考摄入量（DRIs）提供依据。Lyakhovich等［37］应用DNA芯片技术首次揭示了维生素D可能通过调节乳腺癌细胞的FGF27的表达而调节细胞的生长分化。芯片技术可用于单核苷酸多态性（SNPs）检测，以研究人体对于营养素需求的个体差异［38］。

3.2 营养成分的分析与生物活性物质的检测

传统的检测方法对食品的营养成分及活性物质检测是非常繁琐的，而应用生物芯片技术则可以快速准确的分析食品的营养成分与活性物质，对食品的类别和性质进行快速准确的鉴定。

法国Biomerieux公司建立的食品营养分析芯片——“食品专家－ID”可以用于动物食品的品质鉴定，以确认该食品是否货真价实。Li等［39］设计了一种有多个分支的微流路芯片，用于快速分离分析蛋白消解产物，并用串联质谱技术（CE－Chip－MS/MS）进行多肽测序和蛋白定性。Marquette［40］用电化学发光技术改进生物芯片，将乳酸盐氧化酶、胆碱氧化酶、葡萄糖氧化酶及发光氨结合到基片上，以测定葡萄糖、乳酸盐及胆碱。Barella等［41］应用DNA芯片测定大鼠肝脏中VE敏感基因，并由此探索α－生育酚在肝脏代谢中的重要作用。Hadd等［42］在多分支的微流路芯片上用乙酰胆碱酯酶测定乙酰胆碱酯酶抑制剂的含量。乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱与荧光剂（香豆素苯基马来酰亚胺）在线反应产生荧光标记胆碱，用LIF检测。酶抑制剂可降低荧光强度，产生一个负峰，从而达到检测乙酰胆碱酯酶抑制剂的目的。

4 结语

食品成分分析、新产品开发、食品安全全程控制体系等方面对食品分子检验手段提出更多、更高的要求。生物芯片技术因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到研究者的瞩目，特别是基因芯片在人类基因组计划研究中的应用，不仅极大地促进了该项工作的进行，也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展，并迅速在食品科学研究中得到广泛的应用。随着生物芯片技术的不断发展与完善，食品科学研究的逐步深入，生物芯片将会作为一种简便快捷的技术，为食品工业的发展带来极大的便利。

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Application of biochip on food nutrition and safety

TANG Ya－li1，2LU Li－xin1，2ZHAO Wei3

（1.Department of Packaging Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.The Key Laboratory of Food Packaging Techniques and Safety of China National Packaging Corporation，Wuxi，Jiangsu214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China）

The application of biochip in food nutrition and safety，especially the detection of food borne pathegon，analysis of harmful substences and researches on food nutrition，together with the prospect of biochip technique in food industry，were discussed.

biochip；nutrition；food safety

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.047

唐亚丽（1982－），女，江南大学副教授，博士。E－mail：tyl＠jiangnan.edu.cn

2010－06－01