响应面法提取灰树花多糖研究

孙金旭 朱会霞 高小宽 李书珍

陈 尧 林高强 周成铭

（衡水学院，河北 衡水 053000）

响应面法提取灰树花多糖研究

孙金旭 朱会霞 高小宽 李书珍

陈 尧 林高强 周成铭

（衡水学院，河北 衡水 053000）

利用试验设计软件Design－Expert，通过二次回归设计得到灰树花多糖提取量与提取温度、提取时间、乙醇浓度关系的回归模型，该模型能够较好地预测灰树花多糖提取量。在对影响多糖提取量的关键因素及其相互作用进行探讨后，得到的优化提取工艺参数为：提取温度11℃、提取时间10.35h、乙醇浓度96%，此条件下，多糖的提取量为1.72g/L。

灰树花；响应面；提取；多糖

灰树花多糖是灰树花中的重要活性物质之一。药理研究［1］证明，灰树花多糖有明显的抗肿瘤、抗肝炎、降低血压，免疫调节之功效。目前已经开发了多种灰树花多糖保健品［2］。采用生物技术方法利用液体发酵培养灰树花真菌菌丝体，并利用发酵液提取灰树花多糖是目前最经济，最符合环保的方法［3］。但发酵培养后，由于发酵液成分复杂，灰树花多糖的分离提取存在很大困难。目前，对灰树花多糖的提取主要使用醇沉法，对醇沉条件的优化仅限于使用正交法，而对灰树花多糖醇沉法进行响应面优化的未见报道，正交法得到的工艺条件并非真实意义的最佳条件，只是理想条件，不能给出整个区域上的最优值。响应面分析法（RSM）是一种寻找多因素中最佳条件的统计方法，本试验利用醇沉法对灰树花发酵液中的灰树花胞外多糖进行分离提取，并对灰树花多糖的醇提条件进行响应面法优化研究，以期提高灰树花多糖的提取量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰树花菌种：本实验室保藏；

离心机：DT5－3B，北京时代北利离心机有限公司；

发酵罐（7L）：TY4246，上海保兴生物设备工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灰树花多糖提取工艺

灰树花真菌7L发酵罐培养（培养温度28℃、转速200r/min、通气量100L/h、培养时间10d）→灰树花发酵培养液→离心沉淀除菌体（3 000r/min）→灰树花发酵液→醇沉→灰树花粗多糖

1.2.2 灰树花多糖醇沉条件单因素试验设计

（1）醇沉温度的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵上清液，在乙醇浓度95%，pH值7.0，时间8h的条件下，分别设定－4，4，10，20，30，40℃的醇沉温度，进行醇沉试验，测定其多糖提取量。

（2）醇沉时间的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵上清液，在乙醇浓度95%，醇沉温度10℃，pH值7.0的条件下，分别设定2，4，6，8，10，12h的醇沉时间，进行醇沉试验，测定其多糖提取量。

（3）乙醇浓度的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵上清液，在醇沉温度10℃，醇沉时间10h，pH值7.0的条件下，分别 设 定 70%，75%，80%，85%，90%，95%，100% 的 乙醇浓度，进行醇沉试验，测定其多糖提取量。

1.2.3 灰树花多糖提取工艺的响应面分析 采用Box－Behnken试验设计方案［6］，根据单因素试验结果进行响应面分析试验，运用SAS软件的 RSREG （response surface regression）程序对试验点的响应值进行分析。

1.2.4 灰树花多糖的测定 通过发酵罐液体培养获得灰树花真菌发酵液，发酵液3 000r/m离心处理得到发酵上清液，将得到的发酵上清液用乙醇进行醇沉，采用苯酚－硫酸法测定总糖及还原糖的含量。多糖含量按式（1）计算：

2 结果与讨论

2.1 灰树花真菌多糖提取单因素试验

2.1.1 醇沉温度对灰树花多糖提取量的影响 由图1可知，随着醇沉温度的升高，灰树花多糖提取量也逐渐上升。当醇沉温度达10℃时，多糖提取量达到最高（1.45g/L），醇沉温度继续升高时，多糖提取量反而有所减少。分析原因可能为低温不利于灰树花多糖的溶出，温度过高，其他杂质溶出过多，影响到灰树花多糖溶出的缘故。故10℃为灰树花多糖提取的最佳温度。

图1 醇沉温度对灰树花真菌多糖提取量的影响Figure 1 The extracting temperature impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

2.1.2 醇沉时间对灰树花多糖提取量的影响 由图2可知，随着醇沉时间的延长，灰树花真菌多糖提取量也依次增加，到10h时多糖提取量达到最高（1.50g/L），高于10h提取，多糖量下降。故10h醇沉时间为灰树花多糖提取的最佳时间。

2.1.3 乙醇浓度对灰树花真菌多糖提取量的影响 由图3可知，随乙醇浓度的上升，灰树花多糖的提取量也逐渐上升，当乙醇浓度达到95%时，灰树花多糖的提取量最高（1.64g/L），乙醇浓度继续升高，多糖量有所下降，故95%的乙醇浓度为灰树花多糖提取的最佳浓度。

图2 醇沉时间对灰树花真菌多糖提取量的影响Figure 2 The extracting time impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

图3 乙醇浓度对灰树花真菌多糖提取量的影响Figure 3 The ethanol volume percentage impact for Grifola frondosa camphorata polysaccharides extracting

2.2 响应面法优化灰树花多糖提取条件

根据单因素试验结果，对提取温度、提取时间、乙醇浓度3因素3水平共15个试验点（3个中心点）进行响应面分析试验，响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应面法灰树花真菌多糖提取因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for Grifola frondosa

运用SAS软件的RSREG程序对15个响应值进行分析。15个试验点可分为两类：一是析因点，自变量取值构成的三维顶点，共有12个析因点；二是零点，区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差，以多糖提取量（Y1）为响应值，经回归拟合后，确定函数表达式。试验结果见表2。

2.3 模型的建立与显著性检验

用Design Expert软件对表2中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项，可得提取温度、提取时间、乙醇浓度与灰树花多糖提取量之间的多项回归方程，回归方程为：

回归方程显著性检验、方差分析及最佳点值分析，结果见表3。

表2 响应面数据方案及试验结果Table 2 The data plan and result for response surface

表3 三因素三水平中心组和参数估计Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

对表3数据惊醒回归分析，结果显著，模型相关系数的平方即R2＝99.32%，回归方程拟合程度良好，失拟性较小，可用该方程代替真实试验点进行分析。由P值可知，方程的X1、X2、X3、X1X1、X2X2和X3X3对Y值影响极显著，表明该方程并非简单的线性关系，方程二次项对响应值影响也很大，交互项影响不显著，因此交互作用影响较小。失拟项p＝0.381 8，无显著性影响，表明数据没有异常点，不需要分析更高次数的项，模型适当。

通过软件分析，当灰树花多糖产量最高时：X1＝0.077 58；X2＝ 0.173 208；X3＝ 0.232 336，计算后最佳工艺为：提取温度11℃、提取时间10.35h、乙醇浓度96%。此条件下，多糖理论提取量为1.70g/L。为了检验所得结果的可靠性，采用优化条件进行提取试验，实际测得值为1.72g/L，与理论值相比，0.1%以内的相对误差，因此，响应曲面法所得的优化条件，灰树花真菌多糖提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

在单因素试验设计的基础上，对灰树花多糖的醇沉条件进行了三因素三水平的响应面法设计，从而建立了响应值和各个因素之间的数学模型，依据此数学模型可以预测理论提取量。根据回归模型确定了灰树花多糖醇沉的最佳工艺参数：提取温度11℃、提取时间10.35h、乙醇浓度96%。此条件下，多糖的理论提取量为1.70g/L。采用上述优化提取条件进行3次提取试验，实际测得的平均值为1.72g/L，与理论预测值相比，其相对误差在0.1%以内。因此，利用响应面分析方法对灰树花多糖提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential［J］.Altern.Med.Rev.，2002（6）：6.

2 马青，陈石良.灰树花保健饮料加工工艺研的究［J］.食品与机械，2003（3）：22.

3 孙金旭，朱会霞，李书珍.灰树花真菌发酵条件优化研究［J］.食品与机械，2009，25（6）：131～133.

4 Ahuja S K，Ferreira G M，Moreira A R.Application of Plackett－Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium［J］.Biotechnology and Bioengineering，2004（85）：666～675.

Study ongrifola frondosapolysaccharides extracting by response surface method

SUN Jin－xu ZHUH ui－xia GAO Xiao－kuan LI Shu－zhen

CHEN Yao LIN Gao－qiangZHOU Cheng－ming

（Hengshui College，Hengshui，Hebei053000，China）

The regression model，related to the amount ofgrifola frandosuspolysaccharide extraction，extracting temperature，extracting time，ethanol concentration，was obtained by using Design－Expert experimental design software through quadric regression design.The regression model would be a fairly reliable forecast for extraction ofgrifola frandosuspolysaccharide.The optimized extraction parameters were obtained as follows：extraction temperature 11℃，extraction time 10.35h，ethanol concentration 96%.Under the conditions，the extraction amount ofgrifola frandosuspolysaccharide in theoretically reached 1.70g/L.

grifola frondosa；response surface；extracting；REPS

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.038

衡水学院大学生创新课题（编号：2010058）

孙金旭（1975－），男，衡水学院讲师，博士研究生。E－mail：bdsunjinxu＠163.com

2010－05－11