CHO-K1细胞株的建立及其在药物安全性筛选方面的应用

张之东,陈 慧,郝六平,魏 转,李丽娟

(河北化工医药职业技术学院制药系,河北石家庄 050026)

CHO-K1细胞株的建立及其在药物安全性筛选方面的应用

张之东,陈 慧,郝六平,魏 转,李丽娟

(河北化工医药职业技术学院制药系,河北石家庄 050026)

研究了稳定表达h ERG基因的CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株及其在药物研发安全性筛选方面的应用。使用Lipofectamine 2000系统将hERG基因转染入CHO-K1细胞,用Western Blot检测其表达,并进一步通过 FluxORTMThallium A ssay Kits验证;同时使用 FluxORTMThallium A ssay Kits检测Cisap ride和Dofetilide对hERG通道的抑制性。建立了4株稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞株,Cisap ride和Dofetilide对hERG通道的 IC50分别为86.7 nmol·L-1和28.1 nmol·L-1。hERG基因成功地在CHO-K1细胞株实现了稳定表达,此细胞株可用于FluxORTMThallium A ssay Kits系统,用于药物研发安全性筛选,以评估化合物潜在的心脏毒性。

hERG;中国仓鼠卵巢细胞;FluxORTM

人类的hERG基因(human ether-a-go-go-related gene)编码产物是一种电压门控式的钾离子通道。hERG基因是1994年由WARM KE等用小鼠 EAG(ether-a-go-go-related gene)基因同源染色体筛选人类海马cDNA文库分离得到的,同年JIANG等通过候选基因定位法确定了hERG是先天性长QT综合征(long Q-T symp tom,LQ TS)的致病基因之一[1]。人们对hERG基因的关注源于其编码的钾离子通道,在心脏动作电位复极过程中发挥重要的作用。基因突变或药物引起该通道的功能异常可能会引起心脏QT间期延长,进而可引起尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes,TdP)、心室纤颤甚至猝死。TdP是可以致命的,因此诱导TdP的危险导致了药物的撤销和不被批准。hERG钾通道已作为评价化合物潜在心脏毒性的分子靶标,进行候选化合物hERG的安全性筛选,广泛用于新药研发的早期阶段,以利于有效地降低新药研发成本和风险。

FluxORTMThallium Assay Kits试剂盒是Invitrogen公司于近期推出的最新的hERG通道高通量筛选试剂盒,该试剂盒满足了药物研发过程中化合物对hERG通道的安全性筛查。较之传统意义上的膜片钳技术耗时、耗力、耗资,该方法省时、省力、成本低,并且能在真正意义上达到药物研发过程中的高通量筛选要求。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及装置

DM EM培养基,胎牛血清,Lipofectamine 2000系统,FluxORTMThallium A ssay Kits和 G418,购于 Invitrogen公司;Protease Inhibito r Cocktail,Monoclonal Anti-Actin,Cisap ride和 Dofetilide,购于 Sigma-A ldrich公司;质粒抽提试剂盒,购于 Q IAGEN;蛋白 M arker,购于B IO-RAD;Anti-M yc Tag,购于 M illipo re;A nti-mouse IgG,HRP-Linked Antibody,购于CELL SIGNAL ING公司;Western及IP细胞裂解液,购于上海碧云天生物技术有限公司;ECL Western Blot分析装置,购于 GE公司。

1.1.2 菌种和细胞

大肠杆菌 Top-10及CHO-K1细胞,均为本实验室保存;表达载体pCMV-EN TRY-HERG(phERG)购于ORIGENE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

CHO-K1细胞培养基为DM EM补加10%(体积分数)胎牛血清(FBS),温度为37℃,于5%(体积分数)CO2恒温培养箱中培养。细胞复苏之后,在25 cm2方瓶中传代培养。细胞长满瓶底面积约90%时,用0.25%(质量分数)胰酶消化,1∶10进行传代。转染前1日,对消化后细胞计数,稀释细胞数至1×105个/mL,转移至6孔板,2 mL/孔,培养至第2天汇合度大约在60%左右,备用。

1.2.2 质粒准备

质粒抽提使用无内毒素质粒抽试剂盒。提取后,采用核酸电泳确定分子质量的大小,同时使用微量核酸定量仪ND-1000(Nano Drop Technologies公司提供)测定A260/A280,比值为1.80～1.95方可使用,同时进行质粒定量。

1.2.3 转染过程

A液:分别使用无血清的DM EM 250μL,稀释1,2,4μg质粒DNA。B液:使用无血清的DM EM 250 μL,加入Lipofectamine 2000 10μL,室温放置5 min。将A液和B液混合,温和吹打均匀,室温放置20 min。将混合液逐滴沿培养孔的边缘加入到6孔培养板中,前后摇动混合均匀,放入培养箱培养。6 h后,弃去培养液,添加2 m L新鲜的含10%(体积分数)FBS的DM EM。继续培养48 h后,消化培养孔内细胞,使用含G418(800μg/m L)的DM EM完全培养基吹打,后转移至培养皿中培养,3 d换液1次。

1.2.4 单克隆筛选

标记疑似单克隆位置处,用0.25%(体积分数)Trypsin-EDTA消化液浸湿滤纸(滤纸尺寸<5 mm×5 mm),置于所标记克隆位置处,20 s左右放入已经含有 G418选择培养基2 mL的溶液中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落。预先对96孔板除第1排之外的所有孔加含10%(体积分数)胎牛血清的细胞培养液,0.1 m L/孔。将上述细胞液接种于96孔板的第1排,0.2 m L/孔,从中吸取0.1 m L细胞溶液接种于第2排,混合后,从第2排中吸取0.1 mL接种于第3排……一直到第8排,最后一排丢弃0.1 m L细胞液。培养2周左右,转移至24孔板中扩大培养,继续6孔板,待细胞长密之后,计数,通过有限稀释法,至细胞数为5个/m L,铺96孔板,每孔0.1 m L,将剩余细胞冻存。培养2周左右,转移至24孔板中扩大培养,采用Western Blot分析装置验证。

1.2.5 免疫印迹分析

样品经10%(体积分数)SDS-PAGE凝胶电泳,100 V转膜2 h,将蛋白转移至孔径为0.45μm的PVDF膜。在封闭液(PBST+5%(体积分数)BSA)中于37℃孵育1 h。加入用封闭液稀释5 000倍的一抗,于37℃孵育2 h;使用 PBS洗膜3次,每次10 min,用封闭液稀释2 500倍的 HRP标记二抗,于37 ℃孵育1 h。使用 PBS洗膜3次,每次10 min,浸于 Western Blot分析装置3 min,曝光,洗片。

1.2.6 FluxORTMThallium A ssay

实验前1日下午铺96孔板2行,前3个孔为 W T-CHO-K1细胞(野生型),其余为稳定转染hERG的CHO-K1细胞。

2 结果与分析

2.1 CHO-K1细胞的稳定转染

2.1.1 G418最佳筛选质量浓度的确定

在进行转染时,由于Lipofectam ine对细胞膜有损害作用,因而在转染过程中使用的培养基中均未加入双抗(转染后的后续培养过程中也不加入,因为链霉素和 G418均为氨基糖苷类抗生素)。由于每种细胞对G418的敏感程度是不一样的,一般变动范围为100～1 000μg/m L,而不同厂家生产的相同质量浓度的G418的活性可能也不尽相同,因而在做转染之前需进行最佳筛选质量浓度的确定。分别使用100,200,400,600,800,1 000μg/m L,配制筛选质量浓度,铺6孔板,细胞数为20 000个/孔。根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3 d左右更换一次培养基,10～14 d能够杀死所有细胞的最小 G418的质量浓度即为最佳筛选质量浓度。由实验得知最佳筛选质量浓度为800μg/m L。

2.1.2 CHO-K1的稳定转染后的Western Blot鉴定

96孔板中细胞长至孔内1/10左右时,转移至24孔板,长满后消化取2/3裂解,剩余继续传代。细胞裂解提取总蛋白的过程全部在4℃进行,裂解上清液分装并立即冻存于超低温冰箱。取部分裂解上清液进行Western Blot分析,结果见图1。

由图1可见2条带大小均在120 kD左右。据文献报道,hERG基因稳定转染的 HEK293细胞,Western Blot分析结果显示为2条带,大小分别为135 kD和155 kD,这是由于不同的糖基化位点造成的[2-3]。1B12,1G5,3H3,4F8为稳定转染的CHO-K1细胞系;空白为野生型CHO-K1细胞。将50μL粗蛋白用6倍的样品缓冲液稀释,用10%(体积分数)丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳,免疫印迹结果用化学发光法进行检测。

2.2 FluxORTM Thallium Assay Kits在药物研发安全性筛选中的应用

2.2.1 Cisap ride对hERG钾离子通道的抑制作用

Cisap ride(西沙必利),化学名为(+/-)-顺式-4-氨基-5-氯-N-[1-[3-(4-氟苯氧基)丙基]-3-甲氧基-4-哌啶基]-2-甲氧基苯甲酰胺,为胃肠激动剂,促进胃肠动力作用极强,疗效显著。但在1996年出现了心脏毒性的报道,其原因是它能抑制hERG钾离子的通道。FDA在1998年已经发出用药警告,2000年7月起该药在英国、美国和加拿大被停用。法国尽管对该药有一定限制,但仍允许该药继续用于儿科。Cisap ride为hERG钾离子通道,临床上可引起QT间期延长,甚至晕厥和心源性猝死。

在FluxORTMThallium A ssay Kits系统中,使用稳定转染hERG基因的CHO-K1细胞为模型,W TCHO-K1细胞为空白对照,检测Cisap ride对hERG钾离子通道的抑制作用,见图2,其中箭头指示位置表示施加 TI+/K+刺激,荧光激发光波长为490 nm,吸收光波长为525 nm。

图1 Western Blo t分析Fig.1 Western Blot analysis

如图2所见,在 W T-CHO-K1细胞中,在加入 TI+/K+刺激液后,荧光值没有发生显著变化;而在CHO-K1-hERG(未加入抑制剂Cisap ride)细胞中,加入 TI+/K+刺激液后荧光值发生显著变化,在90 s左右,几乎达到了基底值的3倍。这是因为hERG通道对 TI+/K+的通透性引起的,而在W T-CHO-K1细胞中通透性很低。在加入Cisap ride后,由于其对hERG通道的抑制,降低了hERG通道对 TI+/K+的通透,荧光值显著降低。随着 Cisap ride浓度的增大,荧光值变小,呈浓度依赖性,当 浓度达到 1 000 nmol/L和3 000 nmol/L时,几乎与W T-CHO-K1细胞平齐,抑制率接近100%。Cisap ride对hERG通道IC50为 86.7 nmol/L,参见图 3,其中ΔF/F=(荧光值-基线值)/基线值,基线值=平均值(4次),荧光激发光波长为490 nm,吸收光波长为525 nm。据文献报道,使用膜片钳技术测定的 IC50为 6.5～44 nmol/L[1,4-5],与本系统接近。

2.2.2 FluxORTMThallium Assay Kits在药物研发安全性筛选中的应用举例

图2 在 FluxORTM Thallium A ssay Kits系统中Cisap ride对h ERG钾离子通道的抑制Fig.2 Cisap ride’s inhibition of the hERG potassium channel in FluxORTM Thallium Assay Kits

以Dofetilide(多非利特)为例,说明 Flux-ORTMThallium A ssay Kits在药物研发安全性筛选中的应用。Dofetilide为选择性 I型钾离子通道阻滞剂,是由美国 Pfizer公司开发的抗心律失常药物,主要用于治疗心衰、心律失常和心房颤动,2000年5月获 FDA批准在美国首次上市(商品名为 Tikosyn),化学名为 N-[4-[2-[甲基[2-[4-(甲磺酰胺基)苯氧基]乙基]氨基]乙基]苯基]甲磺酰胺。Dofetilide直接作用于hERG通道,抑制 K+内流。Dofetilide可作为阳性化合物检测FluxORTMThallium A ssay Kits系统的稳定性。

在FluxORTMThallium A ssay Kits系统中,不同浓度的Dofetilide对 hERG通道的作用见图4,其中ΔF/F=(荧光值-基线值)/基线值,基线值=平均值(4次);c为多非利特浓度;荧光激发光波长为490 nm,吸收光波长为525 nm。如图4所示,当Dofetilide的浓度大于1 000 nmol/L时,其对hERG通道的抑制率接近100%,完全抑制。据文献报道,Dofetilide对 hERG的 IC50为 10～110 nmol/L[6-8],可以认为与本系统相同。FluxORTMThallium A ssay Kits系统可取代膜片钳技术用于药物研发安全性筛选。

3 讨 论

通过Lipofectamine 2000系统对CHO-K1细胞株转染,并经过Western Blot鉴定检测,确定已经成功构建了稳定表达hERG基因的4株CHO-K1细胞株。1994年研究人员发现了遗传性心律失常LQT的2个新的基因位点,分别位于染色体7q35—7q36和3p21—3p24,其中hERG基因位于7q35—7q36,与LQT2位于同一染色体同一部位并与之紧密连锁。现已发现在hERG上有200多个不同的突变位点,这些突变均导致LQTS。一些抗心律失常药物如第3类抗心律失常药通过抑制hERG钾通道引起获得性LQ T2,一些非抗心律失常药物如三环类抗抑郁药(丙米嗪、阿米替林)、5-羟色胺摄取抑制剂、组胺受体拮抗剂、氟喹诺酮类抗生素、某些抗肿瘤药物等亦可通过改变hERG钾通道结构及功能而引起LQ T2。因此hERG相关的获得性LQ T2已成为评价新药安全性的一个重要指标,一些药物由于抑制了hERG钾通道诱发心律失常而被禁止销售,如西沙比利、特那非丁、格雷沙星等[9]。所以稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞可以用于FluxORTMThallium A ssay Kits系统,用于药物研发安全性筛选。

Cisap ride和Dofetilide对hERG通道的IC50分别为86.7 nmol/L和28.1 nmol/L,与文献报道的使用膜片钳技术的测定值接近。构建的稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞株能检测Cisap ride和Dofetilide的稳定性,基因转染的方法有多种类型,如经典的磷酸钙沉淀法、脂质体转染法和电穿孔法[10]。阳离子脂质体表面带正电荷,与带负电荷的基因结合成复合物,此复合物吸附于细胞表面并将DNA释放进入细胞。阳离子脂质体介导的基因转染具有转染效率高、重复性好、相对安全、细胞毒性小等优点。采用此方法构建的稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞株在药物研发安全性筛选中发挥了重要作用[11]。

4 结 语

建立了4株稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞株,并可成功地用于FluxORTMThallium A ssay Kits系统,用于药物研发安全性筛选。Cisap ride和Dofetilide对hERG通道的 IC50分别为86.7 nmol/L和28.1 nmol/L,与文献报道的使用膜片钳技术的测定值接近。以表达hERG基因的 CHO-K1细胞株为基础,FluxORTMThallium A ssay Kits系统可用于药物研发安全性筛选,以评估化合物潜在的心脏毒性。

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Establishment of CHO-K1 cell lines and its app lication in drug safety screening

ZHANG Zhi-dong,CHEN Hui,HAO Liu-ping,W EIZhuan,L ILi-juan
(Department of Pharmacy,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vacation College,Shijiazhuang Hebei 050026,China)

CHO-K1(Chinese hamster ovary cell)cell lines stably exp ressing hERG gene and its app lication in drug R&D safety screening were studied.hERG gene was transfected into CHO-K1 cellw ith Lipofectamine 2000,and the exp ression of hREG was detected by using Western Blot technology and FluxORTMThallium Assay Kits,p roving the inhibition of hERG by detecting Cisap ride and Dofetilide.Four cell lines stably exp ressing hERG gene was established,and ICTMare,respectively,86.7 nmol·L-1,28.1 nmol·L-1of Cisap ride and Dofetilide.h ERG is transfected into CHO-K1 cell lines successfully,and the cell lines can be used to drug R&D safety screening in FluxORTMThallium Assay Kits.

hERG;CHO-K1;FluxORTM

TQ464;Q81

A

1008-1542(2010)02-0137-05

2009-11-03;责任编辑:张士莹

张之东(1971-),男,河北东光人,讲师,主要从事化学制药方面的研究。

陈 慧,E-mail:chenhuisjz@126.com