苯酚-硫酸法测定破布叶叶的多糖

毕和平，周 贤，陈光英，辜燕飞

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

苯酚-硫酸法测定破布叶叶的多糖

毕和平，周 贤，陈光英，辜燕飞

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

对苯酚-硫酸法测定破布叶叶多糖含量的影响因素进行了考察和优化.实验发现，测定波长为485 nm、苯酚用量1.4 mL、反应温度40℃、反应时间15 min时，在10.0～70.0 g/mL范围内吸光度与多糖含量呈良好的线性关系，相关系数r为0.9998.平均回收率99.2%，相对标准偏差(RSD)1.16%（n=6）.

破布叶；多糖；苯酚-硫酸法

破布叶属植物全世界约有60种，分布于非洲、印度、马来西亚等地，在我国有2种，为破布叶和海南破布叶[1-2].破布叶（Microcos paniculataL.）又名薢宝叶；布渣叶等，主要分布于我国广东、海南、广西、云南等地.破布叶的叶用于清热解毒,消食积.主治感冒、消化不良、腹胀、黄疸、蜈蚣咬伤、腹胀、黄疸、小儿盗汗、作茶饮去食积等[2].破布叶的药用最早见于何克谏（清）所著的《生草药性备要》,称其味酸，性平，无毒，解一切蛊胀，清黄气，消热毒.作茶饮，去食积等[3-4].多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，具有多种药理活性[5-8].多糖含量的测定方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚-硫酸法.本文采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，从方法学上考察了检测波长、显色温度、显色时间、显色剂用量、线性范围、精密度和测定稳定性的影响.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：UV2600紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；FZ-102型微型植物试样粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-C型循环水式多用真空泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂）；FA1604型光电天平（上海精科天平厂）；索式提取器（自制）.

试剂：葡萄糖、苯酚、浓硫酸等均为国产分析纯试剂，所用水为蒸馏水.

材料：破布叶于2009年3月采集于海南省尖峰岭国家森林保护区，经海南师范大学生命科学学院钟琼心高级实验师鉴定为Microcos paniculataL.的叶.自然晾干，粉碎备用.

1.2 标准溶液配制及标准曲线测定

参照文献[9-10]的方法并作改进.精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖0.1000 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得1 mg/mL的葡萄糖标准溶液.精密吸取葡萄糖标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得不同浓度的标准葡萄糖溶液.

精密称取重蒸苯酚12.5 g，加适量水溶解后，转移至250 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀后置于棕色试剂瓶，得5%苯酚溶液，备用.

取不同浓度葡萄糖标准溶液和蒸馏水各2.0 mL，分别置于20 mL具塞试管中，分别加1.4 mL苯酚和浓硫酸7 mL，于沸水中加热15 min，立即放入冷水中，水浴30 min保持40℃，用紫外-可见光分光光度计于485 nm波长下进行测定.

1.3 破布叶的叶中粗多糖的提取与测定

称取粉碎到20目的破布叶的叶2 g，加入约10倍的蒸馏水，80℃水浴回流提1 h.提取的含多糖溶液适当浓缩后转入250 mL三角瓶中，加适量蒸馏水后在沸水浴上溶解，冷却后转入250 mL容量瓶中定容至刻度并摇匀，即得样品溶液，备用.分别精确吸取样品溶液2.0 mL，余下部分按1.2节标准曲线测定部分进行操作,并随行空白对照.

2 结果与讨论

2.1 测量波长选择

精确量取葡萄糖标准液(40 μg/mL)和样品溶液各2.0 mL，余下部分按1.2节标准曲线测定方法操作.显色后，在紫外-可见分光光度计上于400～600 nm波长范围内扫描.结果见图1.可见标准溶液和样品溶液在485 nm处均有最大吸收，选择485 nm为测定波长.

2.2 显色温度选择

分别吸取标准葡萄糖溶液和样品溶液各2.0 mL于试管中，依次加入苯酚液1.0 mL、浓硫酸7.0 mL，摇匀，分别在40、60、80和100℃下加热15 min，取出立即放入冷水中，水浴30 min，然后取出，按照1.2项下方法用紫外-可见光分光光度进行测定.试验证明，测量温度为40℃为最佳显色温度.

2.3 显色时间选择

分别吸取标准品溶液和供试样品溶液2.0 mL于试管中，依次加入苯酚液1.0 mL、浓硫酸7.0 mL，摇匀，分别加热0、5、10、15、20、25和30 min，余下部分按1.2节标准曲线测定方法操作,测定吸光度.由试验结果可知，加热15 min后的标准液和供试样品溶液的吸光度趋于平缓，选择15 min为最佳显色时间.

图1 波长扫描曲线图Fig.1Wavelength scanning curve

2.4 苯酚用量选择

分别吸取标准品溶液和供试样品溶液2.0 mL于试管中，分别加入苯酚液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL，再加入浓硫酸7.0 mL，摇匀，余下部分按1.2节标准曲线测定方法操作,测定吸光度.由试验结果可知，在1.4 mL苯酚用量下，标准品溶液和供试样品溶液的吸光度都达到最高，所以选择1.4 mL为苯酚最佳用量.

2.5 标准曲线的制备

按1.2项进行操作，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度-葡萄糖质量浓度的关系曲线，其标准曲线方程为y=0.0136x－0.01408，相关系数r为0.9998.结果表明，葡萄糖在10～70 μg/mL范围内，其浓度与吸光度线性关系良好，见图2.

2.6 精密度实验

吸取6份葡萄糖标准溶液和样品溶液2.0 mL，分别置具塞试管中，按照标准曲线制备方法，平行测定吸光度，相对标准偏差RSD分别为0.55%（n=6）和0.61%（n=6），精密度良好。

2.7 加样回收率实验

精密吸取供试样品溶液1.0 mL 6份，各加入20.0、30.0、40.0、50.0、60.0和70.0 μg/mL的标准葡萄糖液1.0 mL，按照标准曲线制备方法进行测定吸光度，计算回收率[7].测定和计算结果见表1.平均回收率为99.16%，相对标准偏差RSD为1.16%（n=6）.

图2 标准曲线图Fig.2Standard curve

表1 加样回收率试验Tab.1 Results of spike recovery test

2.8 稳定性实验

精密量取标准品溶液和供试样品溶液各2 mL，按照标准曲线制备方法每隔一定时间测定吸光度.由试验可知，测定显色溶液在120 min内稳定性良好.

3 结论

在苯酚-硫酸法中，测定破布叶叶多糖含量的最佳测定波长为485 nm，显色的温度为40℃，显色时间为15 min，苯酚的加入量为1.4 mL，显色液在120 min内稳定性好.多糖含量在10～70 μg/mL之间与吸光度成良好的线性关系，在最佳提取条件下，测得破布叶叶中的多糖质量分数为0.76%.此测定方法简单灵敏，显色稳定，结果可靠.

[1]陈焕镛.海南植物志(2卷)[M].北京:科学出版社,1977:58-59.

[2]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科学技术出版社,2003:1824-1825.

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[4]毕和平,韩长日,梁振益,等.破布叶叶片中挥发油的化学成分研究[J].林产化学与工业,2007,27(3):125-126.

[5]张怀,章琦,祁东利,等.柏子仁多糖含量测定及其改善睡眠作用研究[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(9):25-27.

[6]李华为,赵素云,刘晓波,等.硒多糖的抗氧化活性及与过氧化氢酶协同作用的研究[J].分析化学,2010,38(9):1256-1260.

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[8]金春华,姜秀莲,王英军,等.灵芝多糖活血化瘀作用实验究[J].中草药,1998,29(7):470-472.

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Study on Phenol-Sulfuric Acid Method for Determination of Polysaccharide Content in Leave of Microcos paniculata L.

BI Heping，ZHOU Xian，CHEN Guangying，GU Yanfei
（College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou571158，China）

The factors affecting the determination of polysaccharide content in Paniculateicrocos eryngii with phe⁃nol-sulfuric acid method were optimized.Results showed that under the conditions of detection wavelength 485 nm,phe⁃nol content 1.4 mL,reactiontemperature 40℃and reaction time 15 min,there is good linearity range from 10.00 to 70.00μg/mL(r=0.9996).The average recovery is 99.2%and the RSD is 1.16%.

Microcos paniculata L；polysaccharide；phenol-sulfuric acid method

R 927.2

A

1674-4942（2010）04-0400-03

2010-09-25

海南省自然科学基金项目（20804）；海南省重点实验室天然药物化学实验室资助项目；海南师范大学有机化学重点学科资助项目

黄 澜