锌依赖的组蛋白去乙酰化酶选择性抑制剂研究进展

刘红椿，杜晓光，耿美玉，

近年来，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)作为药物靶点吸引了众多的关注，并且已经有HDAC抑制剂Vorinostat和Depsipeptide被美国FDA批准以皮肤T淋巴细胞瘤(CTCL)为适应症而上市应用［1］，在实体瘤治疗中的应用也处于临床试验阶段。这标志着HDAC作为新颖药物靶标的概念验证性研究阶段的结束，也预示着HDAC抑制剂作为抗肿瘤药物具有广阔的开发前景。

尽管目前关于HDAC抑制剂的设计研究及作用机制研究越来越多，但是HDAC抑制剂抗肿瘤作用的明确机制尚未阐明。目前人们提出的作用机制很多，包括促凋亡、促分化、细胞周期阻滞、抑制DNA损伤修复、上调肿瘤抑制基因、下调生长因子、氧化应激等等［2－5］，但这些作用机制往往依赖于细胞类型、实验条件及特定的化合物。这种多个作用机制现象的出现要归因于表观遗传变化的广泛性，如组蛋白的乙酰化和去乙酰化能够影响多种基因的转录。更重要的是，HDACs不仅仅能够催化组蛋白的去乙酰化，而且能够催化其他一些重要蛋白(如Hsp90、Tubulin等)和转录因子(p53、STAT1等)的乙酰化。现有的HDAC抑制剂如Vorinostat及其他一些处于临床研究的侯选化合物往往是泛抑制剂［6］，能同时抑制多个HDAC家族成员。而这些不同亚型的HDAC往往具有不同的定位，在细胞功能调控上发挥着不同的作用，并且与不同的疾病类型相关［7－8］。这种作用机制的广泛性使得 HDAC 泛抑制剂如 Vorinostat、TSA、Belinostat、Panobinostat、LAQ824、JNJ-26481585等会破坏多个依赖于蛋白乙酰化的细胞内过程，不仅影响肿瘤的生长和转移［9］，而且会干扰正常的生理功能，使得HDAC泛抑制剂存在潜在的毒副作用。

因此选择性的HDAC抑制剂不仅能够降低毒副作用，而且能为各亚型的生物学功能研究提供探针，具有深远的意义。本文将对HDAC选择性抑制剂进行综述。

1 HDAC家族主要成员的定位和功能

HDAC是一个大的酶家族，其成员目前已知有18个不同的亚型，按种系分为 4 大类:Ⅰ(HDAC 1、2、3、8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9、10)、Ⅲ(SIRT1-SIRT7)和Ⅳ(HDAC 11)［10］。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ为经典家族，是 Zn2+－依赖性的HDAC，而Ⅲ属于Sirtuin家族，是NAD+－依赖的HDAC。目前临床研究的绝大多数HDAC抑制剂能够抑制HDAC的多个亚型，这些亚型往往属于Zn2+－依赖性的HDAC家族。而针对NAD+－依赖的HDAC的抑制剂目前研究较少，在此不予涉及。

不同亚型HDAC通常具有不同的基因表达模式、细胞定位和生物学功能。目前研究发现［11］，HDAC 1、2、3主要定位在细胞核内，在多种组织细胞中表达，并在多种肿瘤细胞中过表达，且与不良预后有关。HDAC 6主要定位于细胞质，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于细胞核与细胞质之间，只在部分组织细胞中表达，但是有研究表明，HDAC5的表达预示着较好的预后，这提示在肿瘤治疗中最好不要抑制此类HDAC亚型。研究表明，在不同类型的肿瘤中HDAC的表达亚型和表达量不同。这种肿瘤选择性的HDAC表达是亚型选择性HDAC抑制剂应用的病理学基础，也提示HDAC抑制剂的选择性不仅能增强药效，而且能降低毒副作用。这些发现也是促使人们开发选择性HDAC抑制剂的原因之一。见Tab 1。

2HDAC选择性抑制剂

应用RNA干扰技术和动物基因敲除技术研究显示，Ⅰ类和Ⅱa类中的一些HDAC亚型，可能是抗肿瘤作用相关的靶标。其中对HDAC 1、2、3的抑制会引起细胞周期阻滞，产生细胞增殖抑制作用［15］;对HDAC 4的抑制会影响DNA损伤修复的过程［16］;对HDAC 6的抑制会影响Tubulin的乙酰化，降低肿瘤细胞的转移能力［17］等。随着HDAC各个亚型的具体调控机制、生物学功能以及与肿瘤类型关系的深入研究，有针对地选择某些HDAC亚型的选择性抑制剂对个体化治疗具有重要意义，也将更受人们的青睐。

2.1 HDAC1选择性抑制剂 HDAC 1是1996年由美国哈佛大学Taunton等［18］发现的第一个哺乳动物的组蛋白去乙酰化酶，它是多种蛋白质复合物的催化亚单位，参与组蛋白和非组蛋白的去乙酰化。HDAC 1的表达在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃肠道癌等都有明显升高，被认为是肺癌、乳腺癌的预后指标［10］。研究发现［19］，HDAC 1 能调控周期相关蛋白的转录，HDAC 1的抑制主要通过上调p21的表达导致细胞周期的阻滞。

MS-275是1999年由 Suzuki等［20］合成的苯甲酰胺类HDAC 1抑制剂。与泛抑制剂的作用机制不同，MS-275不是以Zn2+为结合靶标，而是以活性口袋最狭窄的部位Phe141和Phe198相对的2个苯环为靶点，阻塞了HDAC的生理底物(组蛋白N端Lys乙酰化侧链)伸向催化中心的通道，因此其对亚型选择性明显好于Zn2+为结合靶点的抑制剂。MS-275通过增加肿瘤细胞中周期阻滞蛋白p21的水平，抑制细胞增殖，促进细胞分化，在动物实验中口服抗肿瘤活性好而且毒副作用低［21］。目前该药物正在美国进行白血病及实体瘤的临床Ⅱ期研究。另外，临床研究表明，MS-275与DNA甲基转移酶抑制剂5-阿扎胞苷联用，对第一次化疗失败的高分化的非小细胞肺癌患者有治疗作用，显示了良好的抗肿瘤作用。

2.2 HDAC1/2选择性抑制剂 HDAC 2与HDAC 1具有高达82%的同源性，且二者的作用机制相似，单独酶不具有HDAC活性，必须与辅因子形成复合物才能有去乙酰化酶活性。HDAC 1和HDAC 2可直接与DNA结合蛋白如YY1、SP1等结合。HDAC 2在抑制凋亡中具有重要作用［19］。

2.2.1 Depsipeptide Depsipeptide，又名 FK228、FR901228、NSC630176，是一来源于天然产物的环肽类化合物，其对HDAC 1和HDAC 2的选择性相似。计算机模拟的结果表明，Depsipeptide的硫醇基团可以通过一个水分子与Zn2+结合［22］。Depsipeptide对多种血液肿瘤和实体瘤都具有明显的杀伤作用。目前Depsipeptide已经获得FDA批准用于皮肤T细胞淋巴瘤的治疗，其针对慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病和其他实体瘤的研究正处于临床阶段［23］。

Tab 1 Properties of zinc dependant HDACs

2.2.2 MGCD103 MGCD0103是一种新型的苯氨基苯甲酰胺类HDAC抑制剂［24］。MGCD0103可以抑制多种肿瘤细胞的生长，比泛抑制剂SAHA和HDAC 1特异性抑制剂MS-275的增殖抑制活性更强［24］。而另有研究表明［25］，MGCD0103主要抑制HDAC 1的活性，同时对HDAC 2、3、11都有一定的抑制作用，故其选择性还有待进一步的验证。MGCD0103口服有效，且显示了良好的药效和药代动力学特性，目前正处于多项Ⅱ期临床研究，是治疗血液学疾病和淋巴组织增生疾病的一个比较有前景的化合物［26］。

2.3 HDAC 8选择性抑制剂 Buggy等［27］在2000年发现了HDAC的第8个成员——HDAC 8，其在心脏、肺、肾脏和胰腺中均有表达，在肝中的表达量最高。HDAC 8与HDAC 3的同源性最高，达到34%。Knockdown实验表明HDAC 8对细胞增殖是必须的［28］。HDAC 8在神经细胞瘤中有异常表达，选择性地抑制其活性，可诱导神经细胞瘤的分化［13］，提示应用选择性HDAC 8抑制剂可治疗神经细胞瘤。

PCI-34051是一个低分子量的异羟肟酸类化合物，能特异性抑制HDAC 8的活性。通过激活PLCγ，PCI-34051能够诱导T淋巴瘤细胞和白血病细胞发生caspase依赖性的凋亡，但是对其他造血细胞和实体瘤细胞无明显影响［29］，提示PCI-34051可能发展成为一个高效低毒选择性强的T细胞恶性肿瘤的治疗药物。

2.4 HDAC6选择性抑制剂 HDAC6属于ClassⅡb，其独特之处是拥有两个催化区域:一个起始于第215位氨基酸，另一个起始于第610位，两个催化区高度同源，而且均含有一个与泛素结合的锌指结构区。正常生理条件下，HDAC 6在心、肝、肾、胰等脏器中高表达［30］，而在食道癌［31］和口腔鳞状上皮细胞癌中过表达。选择性抑制HDAC 6对细胞的存活影响不大，但是可以明显增加tubulin和HSP90的乙酰化水平［32－33］，从而降低细胞的运动能力和加速HSP90客户蛋白的降解。代谢活跃的细胞尤其是肿瘤细胞中产生了大量错误折叠蛋白，HDAC 6能促进错误折叠蛋白降解，故HDAC 6的选择性抑制可以严重地破坏细胞处理错误折叠蛋白的能力，导致细胞内的蛋白“垃圾”迅速积累，进而诱发肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有明显影响，因此近期HDAC 6的选择性抑制剂备受关注。

2.4.1 Tubacin Tubacin是 Schreiber领导的研究组通过对7392种小分子的筛选得到的HDAC 6的抑制剂，其抑制了哺乳动物细胞的tubulin去乙酰化，但是对组蛋白的乙酰化水平、基因转录和细胞周期进程没有影响，tubacin能增加tubulin的乙酰化，虽然不影响tubulin的稳定性，但是能够降低细胞的运动性［17］。另外tubacin并不抑制Hsp90的去乙酰化，提示tubacin可能特异性抑制HDAC6-SIRT2复合物的形成，而该复合物负责tubulin的去乙酰化［34］。

2.4.2 5-Aryl-2-(trifluoroacetyl)thiophene 该化合物是由Ontoria等［35］研究的HDAC抑制剂，对HDAC 4和HDAC 6的选择性较好，其抑制HDAC 4和HDAC 6的IC50值分别为310 nmol·L－1和 70 nmol·L－1，对 HDAC 1 的 IC50比 HDAC 6 强40多倍，而且对实体瘤细胞抑制效果较好。

2.4.3 含吡啶丙氨酸的羟肟酸类化合物 Schafer等［36］研究发现在羟肟酸上进行吡啶丙氨酸修饰，可以得到选择性的HDAC 6抑制剂5a，其对HDAC 1的IC50是HDAC 6的25倍左右，在细胞水平能够升高tubulin的乙酰化水平，其对肿瘤细胞的细胞毒活性较HDAC泛抑制剂弱，与蛋白酶体抑制剂硼替佐米有协同致死作用，提示联合用药可作为其应用的一种策略。

上述的亚型选择性HDAC抑制剂，从严格意义上讲，并不具有绝对的选择性。一方面是由于HDAC各亚型在很大程度上的同源性，既照顾到抑制活性又兼顾选择性难度较大;另一方面现有的抑制剂在分子水平的酶活评价时，仅有少数能在11个HDAC亚型上进行全面评价，大多数化合物仅选用若干HDAC酶进行筛选，所得数据不能完全确定其亚型选择性，因此全面筛选是亚型选择性抑制剂开发和评测的重要指标。

3 展望

Tab 2 Inhibitors activity toward HDAC enzymes

目前各种HDAC亚型的特异生物学功能、选择性表达的肿瘤类型等都没有完全阐释清楚，但是结合已有的研究成果可以预测亚型选择性的HDAC抑制剂拥有明显的优势，如对肿瘤组织选择性高、毒副作用较低、可与靶向药物的联合应用［37］等，因此亚型选择性的HDAC抑制剂是各大研究机构和药厂开发的目标。尽管目前有很多HDAC的抑制剂处于不同的研发阶段，但是受限于HADC亚型的同源性较高，且大多数亚型没有晶体结构，选择性的HADC抑制剂数量还是相当有限的，而且亚型绝对选择性的抑制剂更是罕见。随着HDAC亚型生物学研究的深入、晶体结构的健全和完善以及计算机模拟的合理化设计，更多的亚型选择性的HDAC抑制剂将会涌现出来。

［1］ Shabason J E，Tofilon P J，Camphausen K.HDAC inhibitors in cancer care［J］.Oncol(Williston Park)，2010，24(2):180 －5.

［2］ Rosato R R，Grant S.Histone deacetylase inhibitors:insights into mechanisms of lethality［J］.Expert Opin Ther Targets，2005，9(4):809－24.

［3］ Xu W S，Parmigiani R B，Marks P A.Histone deacetylase inhibitors:molecular mechanisms of action［J］.Oncogene，2007，26(37):5541－52.

［4］ Bolden J E，Peart M J，Johnstone R W.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(9):769－84.

［5］ Glaser K B.HDAC inhibitors:clinical update and mechanismbased potential［J］.Biochem Pharmacol，2007，74(5):659 －71.

［6］ 李新刚，吴 青.TSA抑制NB4细胞去乙酰化酶活性并促进细胞周期素激酶抑制剂表达［J］.中国药理学通报，2005，21(2):165－8.

［6］ Li X G，Wu Q.The inhibition of histone deacetylase and expression promotion of cyclin dependent kinase inhibitor in raji cells by trichostatin A［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(2):165 －8.

［7］ 唐丽琴，魏 伟.组蛋白去乙酰化酶抑制剂与炎症免疫性疾病［J］.中国药理学通报，2007，24(1):1 －4.

［7］ Tang L Q，Wei W.Histone deacetylase inhibitors and inflammatoryimmune diseases［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，24(1):1 －4.

［8］ 孟 玫，姜军梅，尹晓燕，等.苯丁酸钠对两种人肝癌细胞抑癌基因表达的影响［J］.中国药理学通报，2005，21(11):1406－7.

［8］ Meng M，Jiang J M，Yin X Y，et al.Effects of Sodium phenylbutyrate on differentiation and induction of antigene in human liver carcinoma cell lines［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(11):1406－7.

［9］ Yasui W，Oue N，Ono S，et al.Histone acetylation and gastrointestinal carcinogenesis［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，983:220 －31.

［10］Bertrand P.Inside HDAC with HDAC inhibitors［J］.Eur J Med Chem，2010，45(6):2095 －116.

［11］Weichert W，Roske A，Gekeler V，et al.Association of patterns of class I histone deacetylase expression with patient prognosis in gastric cancer:a retrospective analysis［J］.Lancet Oncol，2008，9(2):139－48.

［12］Bolden J E，Peart M J，Johnstone R W.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(9):769－84.

［13］Oehme I，Deubzer H E，Lodrini M，et al.Targeting of HDAC8 and investigational inhibitors in neuroblastoma［J］.Expert Opin Investig Drugs，2009，18(11):1605 －17.

［14］Sakuma T，Uzawa K，Onda T，et al.Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2006，29(1):117 －24.

［15］Inoue S，Mai A，Dyer M J，et al.Inhibition of histone deacetylase class I but not classⅡis critical for the sensitization of leukemic cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis［J］.Cancer Res，2006，66(13):6785 －92.

［16］Kao G D，McKenna W G，Guenther M G，et al.Histone deacetylase 4 interacts with 53BP1 to mediate the DNA damage response［J］.J Cell Biol，2003，160(7):1017 －27.

［17］ Haggarty S J，Koeller K M，Wong J C，et al.Domain-selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6(HDAC6)-mediated tubulin deacetylation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(8):4389－94.

［18］ Taunton J，Hassig C A，Schreiber S L.A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p［J］.Science，1996，272(5260):408 －11.

［19］Zhu P，Huber E，Kiefer F，et al.Specific and redundant functions of histone deacetylases in regulation of cell cycle and apoptosis［J］.Cell Cycle，2004，3(10):1240 －2.

［20］Suzuki T，Ando T，Tsuchiya K，et al.Synthesis and histone deacetylase inhibitory activity of new benzamide derivatives［J］.J Med Chem，1999，42(15):3001 －3.

［21］Saito A，Yamashita T，Mariko Y，et al.A synthetic inhibitor of histone deacetylase，MS-27-275，with marked in vivo antitumor activity against human tumors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(8):4592－7.

［22］Furumai R，Matsuyama A，Kobashi N，et al.FK228(depsipeptide)as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases［J］.Cancer Res，2002，62(17):4916 －21.

［23］ Shah M H，Binkley P，Chan K，et al.Cardiotoxicity of histone deacetylase inhibitor depsipeptide in patients with metastatic neuroendocrine tumors［J］.Clin Cancer Res，2006，12(13):3997 －4003.

［24］Khan N，Jeffers M，Kumar S，et al.Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors［J］.Biochem J，2008，409(2):581 －9.

［25］Fournel M，Bonfils C，Hou Y，et al.MGCD0103，a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor，has broad spectrum antitumor activity in vitro and in vivo［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(4):759－68.

［26］Le T C，Siu L L.Promising antitumor activity with MGCD0103，a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor［J］.Expert Opin Investig Drugs，2008，17(8):1247 －54.

［27］Buggy J J，Sideris M L，Mak P，et al.Cloning and characterization of a novel human histone deacetylase，HDAC8［J］.Biochem J，2000，350 Pt(1):199 －205.

［28］Vannini A，Volpari C，Filocamo G，et al.Crystal structure of a eukaryotic zinc-dependent histone deacetylase，human HDAC8，complexed with a hydroxamic acid inhibitor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(42):15064 －9.

［29］ Balasubramanian S，Ramos J，Luo W，et al.A novel histone deacetylase 8(HDAC8)-specific inhibitor PCI-34051 induces apoptosis in T-cell lymphomas［J］.Leukemia，2008，22(5):1026 －34.

［30］李 斌，王济明.组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)与肿瘤［J］.临床和实验医学杂志，2006，5(12):2030 －1.

［30］Li B，Wang J M.Histone deacetylase 6 and tumor［J］.J Clin Exp Med，2006，5(12):2030 －1.

［31］杨 晋，赵绍林，杨新玲，等.HDAC6在食道癌中表达的初步研究［J］.中国实验诊断学，2009，13(11):1577 －1579.

［31］Yang J，Zhao S L，Yang X L，et al.Study on the expression of HDAC6 in esophageal carcinoma［J］.Chin J Lab Diagn，2009，13(11):1577－9.

［32］Zhang Y，Li N，Caron C，et al.HDAC-6 interacts with and deacetylates tubulin and microtubules in vivo［J］.EMBO J，2003，22(5):1168－79.

［33］Bali P，Pranpat M，Bradner J，et al.Inhibition of histone deacetylase 6 acetylates and disrupts the chaperone function of heat shock protein 90:a novel basis for antileukemia activity of histone deacetylase inhibitors［J］.J Biol Chem，2005，280(29):26729 －34.

［34］North B J，Marshall B L，Borra M T，et al.The human Sir2 ortholog，SIRT2，is an NAD+-dependent tubulin deacetylase［J］.Mol Cell，2003，11(2):437 －44.

［35］Ontoria J M，Altamura S，Di M A，et al.Identification of novel，selective，and stable inhibitors of class II histone deacetylases.Validation studies of the inhibition of the enzymatic activity of HDAC4 by small molecules as a novel approach for cancer therapy［J］.J Med Chem，2009，52(21):6782 －9.

［36］Schafer S，Saunders L，Schlimme S，et al.Pyridylalanine-containing hydroxamic acids as selective HDAC6 inhibitors［J］.Chem Med Chem，2009，4(2):283 －90.

［37］Frew A J，Johnstone R W，Bolden J E.Enhancing the apoptotic and therapeutic effects of HDAC inhibitors［J］.Cancer Lett，2009，280(2):125－33.