鞘内注射p-MPPF对异氟烷镇痛作用的影响

马 涛，袁力勇，王 丹，戴体俊，郭忠民，张励才

异氟烷(isoflurane，Iso)镇痛作用突出，理化性质稳定，全麻效能高，对呼吸循环影响小，毒性低，是临床上广泛应用的吸入麻醉药(inhaled anesthetics)。但Iso的麻醉机制目前尚未明确，在诸多麻醉作用中，镇痛作用是最重要、最基本的作用之一。目前认为Iso的镇痛部位主要在脊髓，可能与脊髓甘氨酸(Glycine，Gly)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)、神经元烟碱(neuronal nicotinic acetylcholine，nACh)和肾上腺素 α2等受体有关［1－8］。研究发现［9］，脊髓中不同的 5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)受体亚型介导了5-HT对伤害性信息的调制，其中，脊髓5-HT1A受体与疼痛的关系密切［10－13］。目前，关于Iso的镇痛作用与脊髓5-HT1A受体的关系罕见文献报道。

本研究以小鼠腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)Iso建立镇痛模型，观察鞘内注射(intrathecal injection，it)5-HT1A受体的拮抗剂p-MPPF(4-Fluoro-N-(2-［4-(2-methoxyphenyl)1-piperazinyl］ethyl)-N-(2-pyridinyl)benzamide dihydrochloride)对Iso镇痛作用的影响，以分析此作用与脊髓5-HT1A受体的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠，体质量(20±2)g，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.2 实验药品和仪器 药品:Iso，鲁南贝特制药有限公司，批号:080908;p-MPPF，Sigma公司，用人工脑脊液(artificial cerebral spinal fluid，aCSF)稀释成所需浓度;冰醋酸，上海建信化工有限公司试剂厂，批号:XK13-2010942。仪器:HH-42型快速恒温数显水箱(常州国华电器有限公司);YLS-6B智能热板仪(淮北正华生物仪器设备有限公司);微量进样器(上海医用激光仪器厂);FA1104电子天平(杭州汇尔仪器设备有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 甩尾法［14］小鼠♀♂各半。将快速恒温数显水箱加热到48℃ ±0.5℃。在小鼠尾巴的下1/3做一标记，把标记以下尾巴浸入水中，记录鼠尾自进入水中到甩出水面的时间即甩尾潜伏期(tail-flick latency，TFL)。给药前，每只小鼠测TFL两次，间隔5 min，将TFL＜3 s或＞6 s的小鼠淘汰，取两次的平均值作为基础TFL。各小鼠第2次给药后测定5、12、20、27、35 min 的 TFL，最长观察时间为15 s。

1.3.2 热板法［14］均为♀小鼠。将YLS-6B智能热板仪调至55℃，用药之前测小鼠自放到热板上到舔后足的时间，即热板痛阈(pain threshold in hotplate test，HPPT)2 次，间隔10 min，挑选 HPPT 在 10～20 s之间的小鼠，取两次的平均值作为基础HPPT。第 2 次给药后测定 5、15、25、35 min 的HPPT。

1.3.3 醋酸扭体法［14］小鼠♀♂各半，第2次给药5 min后ip 1.0%冰醋酸0.1 ml·10 g－1致痛，观察各组小鼠15 min内的扭体次数(writhing times，WTs)。

1.3.4 鞘内注射［15］以左手掌心压住鼠身，拇、中二指按压骶骨两侧固定，食指按在双骶骨前缘连线正中点皮肤上(可触知L6棘突)指示进针点，右手持微量注射器与脊柱上方成20°角与 L5－6间隙进针，针尖进入一侧棘突与横突间组织后减成10°角仔细缓慢推进，以鼠尾出现突然侧向运动为成功标志。缓慢注药，注射容积为5 μl，注射持续5 s，留针 10 s。

1.4 实验分组和给药方法 每种方法60只小鼠随机分为6组，分别为:Control组，Iso镇痛组(Iso组)，单用工具药组:M6组、M3组，合用药组:Iso+M6组、Iso+M3组，每组10只小鼠。Control组:ip NS0.1 ml·(10 g)－11 min 后 it aCSF;Iso组:ip Iso(热板法和扭体法:0.3 ml·kg－1，甩尾法:0.4 ml·kg－1)1 min后 it aCSF;M6组、M3组:ip NS 1 min后it 6 μg 或 3 μg p-MPPF/只;Iso+M6组、Iso+M3组:ip Iso 1 min 后 it 6 μg 或 3 μg p-MPPF/只。

2 结果

2.1 甩尾法 单独it p-MPPF对小鼠TFL无明显影响(vs Control组，P ＞0.05)，见 Tab 1。ip Iso后产生明显镇痛作用(P＜0.01);it 6 μg p-MFFP在5、12、20、27、35 min时使小鼠 TFL 缩短(vs Iso组，P ＜0.01)，可恢复到接近用药前水平(P＞0.05);it 3 μg p-MFFP也能使TFL缩短(vs Iso组，P＜0.01或P＜0.05)，不如大剂量p-MFFP作用明显，见Fig 1。

Fig 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon TFL in isoflurane treated mice

2.2 热板法 单用p-MPPF组的HPPT和Control组相似(P＞0.05)，见Tab 2。ip Iso镇痛作用明显且可持续35 min之久(P＜0.01);it 6 μg p-MPPF在5、15、25、35 min 时使小鼠的 HPPT 降低(vs Iso组，P＜0.01)，与用药前差异无统计学意义(P＞0.05);it 3 μg p-MPPF也可使 HPPT降低(vs Iso组，P ＜0.01或P＜0.05)，但不如大剂量p-MPPF作用明显，见Fig 2。

Tab 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPF on TFL in mice(tail-flick test，¯ ± s，n=10)

Tab 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPF on TFL in mice(tail-flick test，¯ ± s，n=10)

Group TFL/s Base 5 min 12 min 20 min 27 min 35 min Control 4.6 ±1.7 4.0 ±1.3 4.9 ±2.2 3.9 ±1.9 5.1 ±2.2 4.8 ±1.8 M6 4.9 ±2.1 4.7 ±1.9 3.7 ±1.4 3.6 ±2.6 4.5 ±2.5 3.5 ±2.3 M3 4.2 ±1.2 4.4 ±2.4 4.8 ±2.5 3.8 ±1.8 3.6 ±1.9 5.2 ±2.6

Fig 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in isoflurane treated mice

Tab 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in mice(hot-plate test，¯±s，n=10)

Tab 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in mice(hot-plate test，¯±s，n=10)

Group HPPT(s)Base 5 min 15 min 25 min 35 min Control14.3 ±3.0 14.7 ±3.2 14.9 ±3.9 15.2 ±4.214.1 ±5.3 M6 15.2 ±5.1 14.2 ±3.5 14.7 ±5.6 13.9 ±2.8 15.0 ±4.1 M3 14.4 ±4.5 14.5 ±6.9 15.1 ±5.8 14.0 ±3.4 14.6 ±3.2

2.3 醋酸扭体法 与Control组相比，ip Iso镇痛作用明显(P＜0.01)而单独it p-MPPF对小鼠15 min内的WTs影响不大(P＞0.05);it 6 μg p-MPPF使小鼠 WTs增加(vs Iso组，P ＜0.05);it 3 μg p-MPPF对 WTs无影响(vs Iso组，P ＞0.05)，见 Fig 3。

Fig 3 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon WTs in isoflurane treated mice

3 讨论

甩尾反射的中枢在脊髓［14］。预实验中我们发现，甩尾法中ip 0.4 ml·kg－1Iso虽可产生一定的镇静作用，但对脊髓反射活动影响很小，因此与另外两种方法(热板法和扭体法)使用的Iso剂量有所不同。实验中选用的工具药p-MPPF是高选择性的5-HT1A受体的拮抗剂，比p-MPPI活性更强。在预实验中，单独it p-MPPF的剂量达到 12.5 μg/只，除 1只小鼠有尿失禁现象外，其它小鼠自主活动正常，无兴奋、惊厥现象。逐渐降低p-MPPF剂量至6 μg/只，仍可明显拮抗Iso的镇痛作用，故本研究中工具药 p-MPPF it最高剂量为6 μg/只。

分布于脊髓的5-HT1受体亚型主要有5-HT1A、5-HT1B、5-HT1C和 5-HT1D受体，研究发现［13］，脊髓背角神经元上的5-HT1A受体与伤害性信号传导过程密切相关。在甩尾实验［10］、福尔马林实验［11］和电刺激实验中［12］，it 5-HT产生的镇痛作用均可被5-HT1A受体阻断剂削弱或取消;it或脊髓微电泳5-HT1A受体激动剂也呈现出明显的抗伤害效应［16］。在福尔马林致痛实验中，对乙酰氨基酚的镇痛作用也被5-HT1A受体的阻断剂取消［13］。本研究结果表明，Iso体表抗伤害作用能够被it p-MPPF所拮抗，说明脊髓5-HT1A受体参与Iso镇痛过程，而且这种拮抗作用呈现出一定的剂量依赖关系。在扭体实验中，大剂量p-MPPF(6 μg)能拮抗Iso的镇痛作用，小剂量p-MPPF(3 μg)无作用，与其他两种方法实验结果对比，拮抗强度减弱。这可能与体表物理刺激和腹腔化学刺激的痛反射途径不同有关。脊髓5-HT1A受体可能是Iso对体表热刺激产生镇痛作用的重要靶位，而与Iso对抗内脏化学刺激作用关系不大。

与以上结果不同，另一些研究显示［17］，it 5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT和Buspirone可明显增强小鼠的甩尾反射，提示5-HT1A受体介导了痛觉的易化效应。这可能是由于给药方式、用药剂量、工具药的特异性以及观察指标和实验过程等的差异引起的。诚如Grasshoff所言［18］，疼痛的产生及调控是涉及多部位多机制的复杂过程，因此吸入麻醉药镇痛作用的具体受体机制还有待进一步研究。

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