万寿菊提取物对松材线虫的毒杀作用

巨云为，樊培峰，奚月明，薛中官

（1.南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037；2.南京林业大学 江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室，江苏 南京 210037；3.江苏省南京市农林局，江苏 南京 210008；4.江苏省连云港市林业技术指导站，江苏连云港 222001）

松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus是松树的一种毁灭性病害。该病自发现以来已经迅速在中国绝大多数松林地区爆发，至今还没有有效的防治方法，目前仍然以药剂防治为主，但效果较差，且污染环境［1］。随着人类文明程度的不断提高，人们的环保意识及对自身生活质量的要求也不断提高，因此，使用高效低毒的药剂来防治线虫，特别是在蔬菜、茶叶、中草药、花卉及园林植物上的应用尤其显得迫切。“生物合理性”农药的研制已成为当今农药研究领域的热点，从植物的次生代谢物中寻找具有杀虫活性的物质，以获得研制新型、环保、和谐杀虫剂的模板化合物就是重要的途径之一［2－6］。菊科Compositae植物是被子植物中最大的科，广布全球，其中中国有240属，特有29属，占中国菊科野生属总数的13.43%。菊科植物化学成分的复杂性和多样性均居植物界之首，潜在着大量的杀菌、杀虫活性成分，具有极高的研究价值和广阔的开发利用前景［7］。本研究通过测定万寿菊Tagetes erecta粗提物杀松材线虫活性，从而为菊科植物源杀虫剂开发与利用提供一定的依据，同时也为直接利用植物材料配制应用农药提供帮助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 松材线虫 松材线虫取自南京地区病死的马尾松Pinus massoniana。用贝曼氏漏斗法分离病树上的松材线虫，在显微镜下经人工挑取纯化，接种在严格灭菌的长满灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，置于28℃培养箱中培养。约7 d后分离培养皿中的松材线虫，用无菌水配制成含松材线虫约100条·滴－1的松材线虫悬浊液，备用。

1.1.2 供试材料 万寿菊的花、茎和根等3个部分。

1.2 粗提物的制备

1.2.1 材料的处理方法 将收集得到的万寿菊材料分成根、茎和花等3个部分，然后将这3部分分别洗净，放在干燥箱中，在50℃的温度下进行干燥处理。干燥完成后，将它们分别用Jw6312型粉碎机粉碎成细粉末状。

1.2.2 粗提物的提取方法 取万寿菊根、茎和花的粉碎物各100 g，分别将它们放在体积分数为99%的乙醇中室温下进行浸泡处理，2 d更换1次乙醇浸液。先用400目网筛过滤1次浸液，然后再对过滤的浸液进行抽虑过滤。连续浸泡提取3次后合并提取液。最后采用旋转蒸发仪将提取液进行减压蒸发，得到3种黏稠状（胶状）粗提物。将得到的胶状粗提物密封，放4℃冰箱中备用。

1.3 生测方法

1.3.1 药液的配制 用分析天平准确称取各种粗提物适量，用无菌水进行溶解，将各种粗提物分别配制成 1.000，0.500，0.100，0.050，0.010，0.001 g·L－1共 6个质量浓度的溶液，备用。

1.3.2 浸泡生测法 取若干直径2 cm的小玻璃培养皿，然后把各种药液按不同质量浓度取3 mL放入小培养皿中，各种提取物做4组平行组，用清水做为对照组。每个培养皿中加入大约100条松材线虫，放在28℃培养箱中培养，24 h观察记录1次松材线虫的死亡率，72 h后结束观察［8］。

2 结果

2.1 提取物的粗提结果

称量蒸发浓缩所得各粗提物质量，计算粗提物得率。粗提物得率 =［浓缩所得粗提物质量/取用的材料的质量（100 g）］× 100%。

所得万寿菊茎的乙醇粗提物为10 g，粗提物得率为10%。所得万寿菊根的乙醇粗提物为8 g，粗提物得率为8%。所得万寿菊花的乙醇粗提物为6 g，粗提物得率为6%。

2.2 粗提物的杀线活性测定结果

观察并统计不同质量浓度的各种粗提物药液对松材线虫的致死率，并采用直线回归法计算毒力回归方程以及半致死浓度C50。

2.2.1 万寿菊各部分粗提物的杀松材线虫活性测定结果 测定结果见图1。

2.2.2 万寿菊各部分粗提物的最终生测结果分析测定结果见表1。从以上图1和表1，我们可以看出，万寿菊的根、茎和花的粗提物对松材线虫的毒杀效果都比较明显，并且从图中可以看出松材线虫的致死率随着粗提物药液质量浓度的增加也有增长的趋势，其中万寿菊根粗提物的杀松材线虫活性最为显著，0.1 g·L－1以上质量浓度时，72 h内的线虫致死率在 90%以上，其半致死质量浓度C50达到 0.006 3 g·L－1。

表1 万寿菊各部分粗提物的生测结果数据分析Table 1 Data analysis about toxicity of marigold extracts against Bursaphelenchus xylophilus

图1 不同质量浓度万寿菊各部分粗提物对松材线虫作用Figure 1 Toxicity of marigold root against the nematode

3 结论与讨论

通过本次实验发现，万寿菊的根、茎和花各部分的粗提物对松材线虫都具有一定的毒性，其中根的粗提物最为显著。随着粗提物药液质量浓度的增加，对松材线虫的毒性也有增加的趋势，当质量浓度达到一定程度的时候就可以全部杀死松材线虫。并且发现，粗提物药液对松材线虫的抑制作用有随着时间的延长而增强的趋势。结合前人的研究和本次实验，进一步说明了万寿菊粗提物具有较强的杀松材线虫活性，在防治松材线虫病方面具有良好的应用前景。

本次实验只是对万寿菊的根、茎和花的粗提物单一的进行了对松材线虫毒性的测试，并没有进行它们之间的混配实验，而且并没有对其粗提取物中所含的有效成分的进一步分离和鉴定，这些将是我们下一步研究的方向和重点。

万寿菊具有同印楝Azadirachta indica，川楝Melia toosendan，烟草Nicotiana tabacum和鱼藤Derris trifoliata等同样的地位，成为从2 400种已记载控害植物中挑选出来的43种广谱控害植物之一，被誉为 “控害的精华”［8－9］。万寿菊化学成分包括噻吩类、精油、色素、黄酮及苷类等。随后的研究又发现万寿菊的提取物对多种线虫和昆虫有毒杀作用，并且对多种植物病原菌有明显的抑制作用［10－11］。Zechmeister和Sease首次从万寿菊花中分离出三聚噻吩和它的衍生物，并有人发现在紫外光（320～400 nm）照射下，噻吩类化合物对线虫有生物活性。Uhlenbroek等测试了从万寿菊根中分出的噻吩及合成噻吩对3种线虫的活性，结果显示万寿菊中的杀线虫活性成分是噻吩物质。乐海洋在从万寿菊中分离杀虫物质，进行光活化基础理论和应用研究时发现，中国生长的万寿菊所含的杀虫有效成分比国外的要高［11-13］，因此，中国的万寿菊在生物农药研究方面有更好的研究价值。

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