荧光原位杂交技术在检测人精子染色体异常中的应用进展

黄 梅 综述，石 红 审校

(大连医科大学附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011)

目前精子染色体检测主要有3种方法：人精子与金黄地鼠卵体外受精法(the hamster egg-human sperm fusion techinque),荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)和引物介导的荧光原位杂交法(PRINS)。总结近10年来国内外学者对精子染色体的研究，FISH以其能够快速、简便、高灵敏度及高特异性检测精子中期和间期细胞核，一次检测成千上万个精子染色体而被广泛应用。FISH技术已用于检测正常人、不育者、染色体平衡易位携带者及肿瘤患者在化疗前后精子染色体非整倍体率的改变，还可用于环境致突变的研究。同时，FISH技术也由起初的单色发展为如今的双色、多色FISH。

多色FISH是在原来单色FISH分析的基础上对研究精子染色体非整倍体的很好补充。这种方法的优点：①可以同时检测多条染色体；②可根据染色体数目异常确定是否为多倍体或非整倍体；③区别减数分裂I(MI)不分离与减数分裂II(MII)不分离。因此，越来越多的实验者采取多色FISH方法分析。

1 精子染色体非整倍体的发生

精子染色体的非整倍体的发生是由染色体数目异常的生殖细胞引起的，起源于减数分裂过程中的染色体分离异常、减数分裂受阻和染色体不分离产生多倍体精子。

2 FISH在正常人精子中非整倍体分析中的应用

染色体数目异常者的父母往往是正常的，表明正常人能产生非整倍体的生殖细胞。迄今为止，除了5、13、14、19号染色体以外的二倍体率均有报道。Martin等[1]的研究显示，性染色体和21号染色体较其他常染色体二体率有明显的升高。精子中各对常染色体不分离导致的二体率大多介于0.10%～0.20%，而性染色体二体的发生率为0.20%～0.40%，二倍体率为0.10%～0.20%，FISH与精卵融合技术所得数据进行比较，结果吻合。

3 FISH在不育男性精子非整倍体分析中的应用

男性不育症病因包括：少精子症、弱精子症、畸精子症及抗精子抗体所致的免疫性不育等。其中少、弱、畸精子症病人较为多见，其染色体异常与不明原因反复流产或死胎、不育之间有相关性[2]。

开展精子FISH研究主要针对不育症人群，鉴于性染色体与不育症的遗传关系，即性染色体对伴性遗传的提示作用，几乎所有的研究都包括性染色体非整倍体率的测定。常染色体的非整倍体研究也具有重要的指导意义。目前，研究较多的常染色体为1、7、13、18、21，其中尤以18和21号染色体研究居多[3-6]，而国内更多是采用性染色体与18号染色体的多色FISH进行实验。

3.1 弱、畸精症与精子染色体非整倍体率

有研究发现，精子质量差的不育男性患者精液中精子非整倍体率有上升趋势，即使是形态正常的精子也有较高的精子非整倍体率[7]，而畸精症患者(WHO1992年标准1%～13%的正常形态)的精子这种趋势更加明显。Templado等[8]研究根据FISH的测定信号，在畸精症患者精子中(13，13)，XX，YY的精子率均较正常对照组明显升高。Harkonen等[9]的研究也支持这个观点。在其研究中，还发现7号和18号染色体也有较高的二体率。Devillard等[10]应用双色和三色FISH检测了巨头或大头多尾的精子，发现几乎所有的精子存在X和Y染色体的至少一个拷贝，多于一半的精子具有1或18的至少两个拷贝。Lewis-Jones等[11]研究了3个严重少畸精症或全畸精症不育男性的精子，发现双头、多核头和多尾精子的发生率很高，用18号染色体和性染色体探针分析，18号染色体和性染色体的二体、三体、四体率分别是100%、76%和82.5%。

3.2 少、无精症患者精子的非整倍体率

近年随着辅助生殖技术的发展，胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术已被广泛用于治疗少精、无精症的不育患者，但该技术避开了卵子对精子的自然选择，容易把异常的精子特别是染色体异常精子注射入卵子内，增加了将遗传异常传递给后代的危险性。因此，需要对患者进行精子FISH的研究和胚胎种植前遗传学诊断(PGD)，筛查非整倍体，以便对需要行ICSI的夫妇进行遗传学咨询。

国内外研究显示，少精患者的精子非整倍体率较高。王喜良等[12]采用18、X、Y染色体探针对严重少精症患者精液中精子的非整倍体进行检测，发现严重少精子症患者精子18、性染色体二体率和二倍体率同正常对照组比较差异有显著性意义。

男子无精症可被分为梗阻性和非梗阻性无精症两种。前者睾丸生精功能正常，因输精管阻塞使产生的精子无法排出体外；后者是因为睾丸本身生精功能障碍而不能或只产生极少的精子，精液中查不到精子。其中非阻塞性无精症患者想达到自体精子受精，需要睾丸取精行ICSI，但由于睾丸取精的不成熟性，其染色体的非整倍体率也较高。

Palermo CTD[13]对18、21、X、Y染色体FISH研究的统计表明，睾丸取精的精子总的非整倍体率高达11.4%，远远高于附睾取精(1.8%)和射精(1.5%)，其中以性染色体的非整倍体率最常见。阻塞性无精症则需附睾取精行辅助生育治疗，而附睾精子和射出精子的非整倍体率差异无显著性意义。在非阻塞性和阻塞性无精症中，最常见的非整倍体形式为性染色体的二体，而在射出精子最常见的是常染色体二体。Martin等[14]的研究也证实上述观点。

4 FISH在检测平衡易位携带者精子染色体非整倍体的应用

染色体平衡易位是染色体结构异常的常见形式之一，虽然染色体平衡易位携带者的一般表型及智力正常，但其精子在减数分裂中会产生染色体非平衡配子，与卵子结合后形成的胚胎可能因发育异常形成畸形胎儿，甚或流产。曾勇等[15]应用三色FISH通过探讨外周血染色体平衡易位患者在精子发生过程中染色体分离模式，预测携带者在胚胎移植前PGD中得到正常表型胚胎的概率,为PGD的应用提供客观依据。

罗伯逊易位是平衡易位的一种特殊形式，目前对此方面研究的较多。Rives等[16]对t(13；15)患者精子染色体分析，其非整倍体率异常配子发生率为18.01%。Ogur等[17]对精子染色体分析中发现，罗伯逊易位染色体间存在染色体间效应，即除参与易位的染色体外，其他染色体非整倍体率也可能受到影响。

5 FISH在有毒物接触史及睾丸癌化疗后精子非整倍体分析中的应用

有研究发现，接触苯类、二氧化硫、氰化物等物质工人的精子染色体非整倍体率较正常对照组显著升高。Xu等[18]分析30例丙烯腈暴露男性精子染色体非整倍体率，暴露组性染色体二体率为0.69%，对照组为0.35%，差异显著；XY二体是暴露组中最常见形式。

De Mas等[19]采用FISH方法研究睾丸癌患者PEB化疗后6～18个月精子细胞非整倍体，使用7、16、18、X、Y染色体探针。结果表明，精子的二倍体率和16、18二体，XY精子显著增加，推测精子生成回复阶段的精子非整倍体可能是PEB疗法的副作用，建议患者在化疗期间避孕，化疗结束妊娠亦应进行遗传咨询和监测。

FISH技术用于研究精子染色体结构，方法简单，适合对大量人精子进行非整倍体的研究。男性不育与精子染色体异常存在潜在相关性，对精液异常的男性不育患者治疗前进行非整倍体分析，有助于优生和遗传咨询。

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