双酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响*

王晓杰，郑喜群，刘晓兰，崔力

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔，161006)

双酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响*

王晓杰，郑喜群，刘晓兰，崔力

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔，161006)

采用4种蛋白酶(Neutrase酶、Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶)对高底物浓度(24%)玉米黄粉进行双酶复合水解，研究复合水解对玉米蛋白酶解效率及玉米肽抗氧化活性的影响。结果表明，双酶复合水解可有效提高玉米蛋白的酶解效率，尤其是Flavourzyme酶与Alcalase酶复合，可使水解度提高26.85%，但酶解效率与抗氧化活性之间无直接对应关系。双酶复合水解对羟基自由基清除率影响较小，清除率均在90～100%范围内，与5%VC溶液的清除率相当;对DPPH自由基和超氧阴离子清除率影响较大，且两者的变化规律相反。

玉米肽，双酶，抗氧化活性

据美国农业部统计，2009年世界玉米总产量约为7.94亿t，同年我国玉米总产量约为1.6亿t，产量仅次于美国，是全球第二大玉米生产国和消费国。玉米中含有64%～78%的淀粉，是生产淀粉最为理想的原料。目前，我国对玉米的深加工一般均指玉米所含淀粉的深加工，产品包括淀粉、淀粉糖和变性淀粉等。采用湿法生产淀粉时，可以分离出占玉米干基6%左右的副产物——玉米黄粉(corn gluten meal，CGM)。玉米黄粉中约含62% ～71%的蛋白质，其主要组分是玉米醇溶蛋白(65% ～68%)和谷蛋白(22% ～33%)，还有少量的球蛋白(1.2%)和白蛋白［1］，是湿法玉米淀粉加工中产量最大、蛋白质含量最高的副产物。玉米蛋白具有的氨基酸组成不平衡、水溶性差等特点，限制了其在食品工业中的应用，目前主要作为饲料使用。但是，与其他谷物蛋白相比，玉米蛋白含有高比例的亮氨酸(19.3% ～21.1%)、丙氨酸(8.3% ～10.5%)、异亮氨酸(5.0% ～6.2%)、脯氨酸(9.0% ～10.5%)等疏水性脂肪族氨基酸［2］，且在其多肽链中存在着不同的功能区，这些因素为玉米蛋白功能性质的表现提供了良好的原料优势。研究表明，采用酶法改性技术可将玉米蛋白的功能性质释放出来。改性后的玉米蛋白除具有高溶解性、低粘度等物化性质外，还具有降血压［3］、抗氧化［4］、消除疲劳［5］、促进乙醇代谢［6－7］等生理活性。但采用单酶对玉米蛋白进行改性时，存在原料利用率低、生理活性弱等缺点，水解度仍处于相对较低的水平。本实验利用蛋白酶催化特异性位点的不同，采用双酶复合水解的方法，在提高玉米蛋白酶解效率的同时，分析了双酶复合作用对玉米肽体外抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米黄粉，由黑龙江省青冈县淀粉厂提供;Neutrase酶、Flavourzyme酶、Alcalase酶和 Protamex酶，均购自丹麦诺维信公司。

1.2 试剂

DPPH和VC为Sigma产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

TV1901紫外可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限公司;水浴振荡器，上海跃进医疗器械厂;pH计，上海雷磁仪器厂。

1.4 实验方法

水解度的测定:pH －Stat法［8］。

超氧阴离子清除率的测定:邻苯三酚自氧化法［9］。羟基自由基清除率的测定:参照文献［10］。DPPH自由基清除率的测定:参照文献［10］。

1.5 蛋白酶的最适酶解条件

在高底物浓度(24%)下，Alcalase酶:E∶S=3%、60℃、pH 值 8.5、2 h;Neutrase 酶:E∶S=1%、45℃、pH 值 7.0、3 h;Flavourzyme酶:E∶S=5%、50℃、pH 值6.0、1 h;Protamex酶:E∶S=1%，50 ℃，pH 值 7.0，3 h。

2 结果与讨论

2.1 Alcalase酶与其他蛋白酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响

第一阶段水解采用Alcalase酶(简写A酶)，在其最适酶解条件下水解2 h后，分别加入Flavourzyme酶(简写F酶)、Neutrase酶(简写N酶)、Protamex酶(简写 P 酶)，再分别水解1 h、3 h、3 h，均以第二阶段不加酶作为对照。实验过程中按一定时间调整反应初始pH值，测定玉米蛋白的水解度。水解完成后，水解液在沸水浴中灭酶活5 min，于5000r/min条件下离心10 min获得玉米肽的混合物。测定玉米肽对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除率，实验结果如图1、图2所示。

图1 Alcalase酶与其他酶复合对水解度的影响

图2 Alcalase酶与其他酶复合对自由基清除率的影响

从图1可以看出，在水解初期，Alcalase酶解反应速度很快，随后逐渐减慢，到2 h时反应基本停滞。再分别加入F酶和P酶，水解度迅速提高后又趋于平缓，与 Alcalase单酶水解相比水解度增加了8.39%。由于Alcalase酶水解专一性强，在其最适条件下水解2 h后，会暴露出较多利于F酶和P酶的酶解位点，所以水解度提高的幅度较大。而N酶的加入并未使水解度有效地提高，甚至较Alcalase单酶水解时略低，原因是第一阶段添加的Alcalase酶在新的条件下又重新水解玉米蛋白，且其催化效率高于N酶，从而抑制了N酶的催化活性。

玉米蛋白中含有较多的疏水性氨基酸，而Alcalase酶是一种内切肽酶，优先水解疏水性的、分子量较大蛋白质或肽段，可以制备出末端具有疏水性氨基酸的短肽。由于肽的抗氧化活性与疏水性氨基酸有关 ，所以玉米蛋白经Alcalase酶改性后，水解产物具有体外抗氧化活性。又由于第二阶段加入的蛋白酶具有不同的底物专一性，导致酶解液中肽段的种类和数量均不同，因而玉米肽具有不同的体外抗氧化活性。由图2可以看出，第二阶段加入P酶和N酶，可以使玉米肽的体外抗氧化活性提高，尤其是超氧阴离子清除率，分别提高了10.53%和6.26%。原因是肽的抗氧活性与产物中肽含量及其分子质量有明显的相关性［11］，P酶和N酶在Alcalase酶的基础上，继续酶解反应体系中的大片段，使多肽链进一步变短，反应体系中肽含量增加，玉米肽的抗氧化活性增强。第二阶段加入F酶使DPPH自由基清除率提高19%，而超氧阴离子清除率却降低1.61%。原因是F酶具有的外切酶催化活性，将出现在肽链末端的具有抗氧化活性的氨基酸如Val、Leu又水解掉，使清除能力降低。也可以说明F酶对Alcalase酶的水解物起到再作用的效果。

2.2 Neutrase酶与其他蛋白酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响

第一阶段水解，采用N酶，在其最适酶解条件下水解3h后，分别加入F酶、Alcalase酶、P酶，再分别水解1、2、3 h，其余操作同2.1，实验结果如图 3、图4所示。

图3 Neutrase酶与其他酶复合对水解度的影响

图4 Neutrase酶与其他酶复合对自由基清除率的影响

从图3可以看出，N酶对玉米蛋白水解3 h后，可使玉米蛋白高级结构发生部分改变，包埋在蛋白质内部的酶解位点暴露出来，加入第2种蛋白酶后，水解度呈递增趋势。由于各种蛋白酶的催化特异性及作用位点的差异，水解度的增加幅度不同。其中，第二阶段加入Alcalase酶使水解度的提高幅度最大，与N单酶水解相比提高了23.90%。N酶与P酶复合使酶解效率提高幅度较小，可能是因为两者均为作用位点广泛的蛋白酶，在水解过程中竞争作用位点，使后续酶作用效果较差。

由图4可以看出，N酶单酶水解时，玉米肽对羟基自由基的清除率达100%，与5%Vc溶液的清除率相当;对DPPH自由基也具有很强的清除能力，清除率可达83%，但其对超氧阴离子清除率仅为0.71%。第二阶段加入Alcalase酶，酶解效率大幅度提高，肽链长度变短，使一些具有抗氧化活性的氨基酸出现在肽链末端，羟基自由基和超氧阴离子清除率提高。又由于Alcalase酶酶解效率高，水解液颜色呈墨绿色，相同体积的样液对DPPH自由基清除时的颜色反应有干扰，导致DPPH自由基清除率降低了59%。第二阶段加入F酶，其外切酶活性使超氧阴离子和羟基自由基清除率明显降低，但对DPPH自由基清除率略有提高，说明发挥DPPH自由基清除能力的可能是一些具有抗氧化活性的游离氨基酸，而末端带有疏水性氨基酸和碱性氨基酸的肽段具有超氧阴离子清除能力。

2.3 Protamex酶与其他蛋白酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响

第一阶段水解，采用P酶，在最适酶解条件下水解3h后，分别加入F酶、N酶、Alcalase酶，再分别水解1、3、2 h，其余操作同 2.1，结果如图5、图6 所示。

图5 Protamex酶与其他酶复合对水解度的影响

从图5可以看出，双酶复合水解时，水解度总体呈递增趋势，提高的幅度取决于第二阶段添加蛋白酶的种类。其中，P酶与Alcalase酶复合效果最好，可使水解度提高21.63%，水解产物抗氧化活性的变化规律与N酶和其他蛋白酶复合时相同。可能是由于P酶与N酶均为中性蛋白酶，在作用位点上存在着相似性，所以和相同的蛋白酶复合后，水解产物的抗氧化活性呈相同的变化趋势。

2.4 Flavourzyme酶与其他蛋白酶复合水解对玉米肽抗氧化活性的影响

第一阶段水解，采用F酶，在其最适酶解条件下水解1h后，分别加入P酶、Alcalase酶和N酶，再分别水解3、2和3 h，其余操作同2.1，实验结果如图7、图8所示。

图6 Protamex酶与其他酶复合对自由基清除率的影响

图7 Flavourzyme酶与其他酶复合对水解度的影响

图8 Flavourzyme酶与其他酶复合对自由基清除率的影响

由图7可知，在F酶水解反应基本停滞时，分别加入P酶、Alcalase酶和N酶，只有Alcalase酶能有效地提高玉米蛋白的酶解效率，其他蛋白酶效果不明显。可能是由于F酶解效率低，作用玉米蛋白1 h后，未能使玉米蛋白高级结构发生有效的改变或改变的幅度较小，第二阶段再加入同样酶解效率相对较低的N酶和P酶，未能使酶解效率有效地提高。

由图8可以看出，F酶单酶水解时，玉米肽对羟基自由基和 DPPH自由基清除率较高，分别达到95.13%和84.93%，但其对超氧阴离子的清除能力却为0。原因是F酶解效率低，酶解产物中肽段过长，具有抗氧化活性的一些氨基酸未能出现在肽链的N-末端或C-末端，超氧阴离子的清除能力显示不出来。第二阶段加入Alcalase酶，虽使酶解效率大幅度提高，但未能有效地提高玉米肽的抗氧化活性;而P酶和N酶虽酶解效率低，但对玉米肽抗氧化活性的提高有明显促进作用，尤其是与P酶复合后，超氧自由基清除率提高了12.85%，与0.5%Vc溶液的清除能力相当。说明抗氧化活性与酶解效率之间无直接对应关系，并不呈现酶解效率越高抗氧化活性越高的变化规律。抗氧化活性肽由特殊氨基酸序列组成，只有在特定的水解度范围内才能表现出抗氧化活性。

3 结论

双酶复合水解可有效提高玉米蛋白的酶解效率，且酶解效率与抗氧化活性之间无直接对应关系。双酶复合水解对羟基自由基清除率影响较小，超氧阴离子和DPPH自由基清除效果影响较大，且两者的变化趋势相反。其中，F酶可有效提高玉米肽DPPH自由基亲清除率，P和N酶对超氧阴离子清除率的提高有促进作用。所以，在玉米肽加工中可以针对不同自由基的要求，选用不同的蛋白酶组合对玉米蛋白进行改性，以制备出具有高抗氧化活性的玉米肽。

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The Effect of Double Proteases Multi-hydrolysis on Antioxidant Activities of Corn Peptides

Wang Xiao-jie，Zheng Xi-qun，Liu Xiao-lan，Cui Li
(Heilongjiang Key Laboratory of Agricultural Products Processing，College of Food and biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)

The proteases(Neutrase，Alcalase，Protamex，Flavourzyme)were used to perform multi-hydrolysis of high corn gluten meal concentration(24%)，and the effects of double proteases on hydrolysis efficiency of corn protein and antioxidant activities of corn peptides were studied.The result showed that the hydrolysis efficiency of double proteases was better than that of single protease，and Flavourzyme combining with Alcalase was the optimal design.In this condition，the degree of hydrolysis was increased 26.85%.The efficiency of hydrolysis was not positive correlation to the antioxidant activities of corn peptides.The scavenging rate of hydroxyl radical was 90% ～100%，equivalent to the effect of 5%Vitamin C solution.The multi-hydrolysis of double proteases had an obvious influence on the clearance rate of superoxide anion and DPPH radical of corn peptides，while the changes in the clearance rate of superoxide anion were contrary to that of DPPH radical.

corn peptide，double enzyme，antioxidant activities

硕士，讲师(郑喜群教授为通讯作者)。

*黑龙江省自然科学基金(B200919)，黑龙江省教育厅海外学人

科研资助项目(1153h24)

2010－04－15，改回日期:2010－05－19