人绒毛膜促性腺激素对人PBMC产生MIF的影响*

邢冬红 赵谨莹 肖振霞 李会强 白 虹

人绒毛膜促性腺激素（hCG）是妊娠期间由胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。除了具有刺激黄体分泌孕酮以维持妊娠的功能外，hCG还具有一定的免疫调节功能。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）属于促炎症细胞因子，它是一个多效性分子，有很多分子参与并介导其功能的表达。目前已知MIF参与多种生理生化过程，如：炎症、免疫应答、细胞增殖、血管生成和肿瘤形成等过程[1]。但有关MIF在妊娠期间的合成、分泌、分布以及功能表达还鲜有报道。hCG影响多种细胞因子的转录和表达[2]。本文利用荧光定量PCR方法，探讨hCG对外周血单核细胞（PBMC）中MIF mRNA转录的影响，为阐明hCG对细胞因子调节作用的机制，解释hCG在生理及某些病理过程中的调节作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 于2007年1月采自天津市血液中心健康献血者新鲜外周血，用淋巴细胞分离液（购自中国医学科学院血液病学研究所）分离获得人PBMC，细胞计数后悬浮于含15%小牛血清RPMI 1640（Gibco）的培养液中。ABI 7000荧光定量PCR 仪（ABI公司，美国），重组hCG（r-hCG）（10 000 U/mL）购自天津鼎天生物技术有限公司,细胞培养液RPMI 1640（Gibco公司），细菌脂多糖（LPS）购自Sigma公司，反转录系统试剂盒（PROMEGA公司，美国），荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 MIF引物：上游5′-GCCCGGACAG GGTCTACA-3′，下游 3′-CTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT-5′；合成产物322 bp。β-actin 引物：上游 5′-CCCAAGGCCAA CCGCGAGAAGAT-3′，下游 3′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCA G-5′；合成产物219 bp。均由上海生工生物技术服务有限公司设计并合成。

1.2.2 人PBMC的分离 参考文献[3]分离人PBMC。

1.2.3 不同浓度r-hCG对MIF mRNA转录的影响 将上述PBMC悬液分成5组，每组分别加入100 IU/mL、10 IU/mL、1 IU/mL、0.1 IU/mL和0 IU/mL的r-hCG，每组3孔，每孔细胞浓度1×106/mL，每孔再加入2 μg/mL LPS激活细胞，混匀后于37℃，5%CO2条件下培养2 h，取出后1 500 r/min离心10 min，并提取沉淀细胞RNA。

1.2.4 r-hCG作用不同时间对MIFmRNA转录的影响 将上述PBMC悬液分成7组，每组3孔，每孔1 mL含1×106细胞，每孔分别加入 LPS(2 μg/mL)和 r-hCG(100 IU/mL)刺激细胞，混匀后 37 ℃，5%CO2条件下培养，分别于 0、0.5、1、2、4、8、16 h收获细胞并提取RNA。

1.2.5 RNA提取 严格按试剂盒说明书进行。提取的RNA经电泳证实呈现两条清晰锐利的18 S和28 S条带，紫外分光光度计测定其260/280 nm比值为1.7～2.0。

1.2.6 逆转录（RT）合成cDNA 逆转录体系总体积20 μL：总RNA1 μL，dNTP（10 mmol）2 μL，AMV1 μL，Oligo dT（2.5×10－6mol/L）1 μL，RNA 酶抑制剂 0.5 μL，MgCl2（25 mmol）4 μL，10×Buffer2 μL，去 RNA 酶水 8.5 μL.RT 条件为 55 ℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。保存cDNA于－20℃ 冰箱，以备后续荧光定量PCR用。

1.2.7 荧光定量PCR检测 PBMC中MIF mRNA转录水平按试剂盒说明书配制25 μL PCR扩增反应体系：12.5 μL SYBR Green 混合物（×2），0.2 μL cDNA，1 μL 引物混合物（5 ×10-6mol/L），11.3 μL H2O。PCR 反应条件：50 ℃ 2 min,95 ℃10 min，95℃15s，60℃30s，72℃30s，40个循环后再以 72℃10 min，1循环。反应结束后，采用ABI prism 7000 sds荧光定量PCR分析系统分析裂解曲线。

1.3 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件分析所得数据，数据用均数±标准差（±s）表示，数据用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度r-hCG对LPS诱导人PBMC中MIF mRNA转录的影响 在实验浓度范围内，含有一定浓度r-hCG的实验组与不含r-hCG的对照组相比，MIF mRNA的转录水平差异有统计学意义（均P<0.05），见表1。 拟合回归方程Y赞=e(1.005+0.669x)，（Y赞：MIF/β-actin，x：r-hCG 浓度）。

2.2 100 IU/mL r-hCG作用不同时间对LPS诱导人PBMC中MIF mRNA转录的影响 在100 IU/mL的r-hCG作用下，在刺激后2 h后，MIF基因转录水平达到峰值，与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。随后MIF的mRNA水平开始回落，到第8h和第16h时，MIF基因转录水平基本回到刺激前的水平，与对照组差异无统计学意义，见表2。拟合回归方程x：时间）。

表1 不同浓度r-hCG对PBMC中MIFmRNA转录的影响（n＝3，±s）

表1 不同浓度r-hCG对PBMC中MIFmRNA转录的影响（n＝3，±s）

*P＜0.05

组别统计学处理r-hCG(IU/ml) MIF/β-actin 组比t LPS①LPS+r-hCG②LPS+r-hCG③LPS+r-hCG④LPS+r-hCG⑤--0.1 1.0 10 100 0.82±0.15 1.13±0.17 2.90±0.40 3.45±0.40 4.92±0.36①∶②①∶③①∶④①∶⑤2.60 7.03*14.35*24.23*

表2 100 IU/mL r-hCG作用不同时间对PBMC中MIF mRNA转录的影响 （n＝3，±s）

表2 100 IU/mL r-hCG作用不同时间对PBMC中MIF mRNA转录的影响 （n＝3，±s）

*P＜0.05

r-hCG作用时间(h)统计学处理MIF/β-actin 组比t 0①0.5②1③2④4⑤8⑥16⑦0.70±0.11 7.83±1.30 12.28±1.62 12.40±0.45 7.00±0.41 1.01±0.21 0.67±0.14①∶②①∶③①∶④①∶⑤①∶⑥①∶⑦9.47*12.08*38.95*20.93*1.68 0.31

3 讨论

MIF是一个由115个氨基酸残基组成的分子质量为12.5 ku的蛋白，属于炎症诱发细胞因子，可直接抑制巨噬细胞的移动，参与多种生理生化过程。已有研究发现，MIF参与了整个妊娠过程，且hCG可以诱导和调控MIF的表达和分泌[4]。如Akoum等[5]报道hCG可以诱导子宫内膜基质细胞合成并分泌MIF，怀孕前3个月，子宫内膜细胞及滋养层细胞都能表达MIF。表明在植入期及胚胎发育早期，该因子起了某种作用。hCG并没有影响MIF mRNA在细胞中的稳定性，而主要是通过提高MIF基因的转录水平来发挥作用。由于MIF可以促进早期血管形成并参与免疫修饰，并且有抑制自然杀伤细胞（NK）活化等特性，可能在胚胎植入及生长发育的过程中，MIF作为一种可引起子宫内膜变化的重要影响因子的细胞介导物，并受hCG诱导。而hCG作为人类激素中碳水化合物含量最高的糖蛋白激素，其主要生物学活性是刺激母体黄体分泌孕酮，在维持早期妊娠中发挥着重要作用。正常妊娠时，胚胎种植后第1天即可在母体血清中检测到hCG，至妊娠的60～90 d hCG血清水平达高峰，于妊娠中期降至较低水平。研究发现，不仅hCG，妊娠早期妇女的PBMC也有促进黄体分泌孕酮的作用[6]，提示PBMC在妊娠早期的内分泌系统中具有重要作用。本实验将不同剂量的hCG作用于体外培养的PBMC，发现一定剂量的hCG可逐渐增加PBMC产生MIF。采用RT-PCR方法分析PBMC中MIF mRNA的转录水平，发现hCG对MIF表达的调控是发生在基因转录水平上的，且在一定浓度范围内与hCG的浓度呈正相关。另外，笔者进行了hCG作用不同时间对PBMC中MIF mRNA转录水平的影响实验，发现在一定浓度hCG的作用下，hCG在很短时间内即可增强MIF基因转录水平，在1～2 h就可达到峰值，随后开始回落，在第8小时基本回到刺激前的水平，表明hCG对MIF的调控是一种短时的效应。hCG可能是通过调控MIF的表达而参与巨噬细胞趋化及炎症反应，但MIF是否在hCG诱导下参与了妊娠的发生和发展，还有待于进一步研究。

[1]Nishihira J.Macrophage migration inhibitory factor(MIF):its essential role in the immune system and cell growth[J].J Interferon Cytokine Res,2000,20(9):751-762.

[2]Davies S,Byrn F,Cole LA.Human chorionic gonadotropin testing for early pregnancy viability and complications[J].Clin Lab Med,2003,23(2):257-264.

[3]张玉环，陈保疆，焦振山,等.特应性皮炎患者单个核细胞Th1/Th2和IFN-γ及IL-4 mRNA表达[J].天津医药,2006,34(12):833-835.

[4]Wada S,Kudo T,Kudo M,et al.Induction of macrophage migration inhibitory factor in human ovary by human chorionic gonadotrophin[J].Hum Reprod,1999,14(2):395-399.

[5]Akoum A,Metz CN,Morin M.Marked increase in macrophage migration inhibitory factor synthesis and secretion in human endometrial cells in response to human chorionic gonadotropin hormone[J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(5):2904-2910.

[6]Nakayama T,Fujiwara H,Maeda M,et al.Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)in early pregnancy promote embryo invasion in vitro:HCG enhances the effects of PBMC[J].Hum Reprod,2002,17(1):207-212.