紫菜薹子叶离体培养不定芽诱导频率的研究

林小芳，付明星，刘乐承

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

紫菜薹子叶离体培养不定芽诱导频率的研究

林小芳，付明星，刘乐承

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

为比较紫菜薹不同基因型之间的子叶不定芽诱导频率，以6个紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)品种为试材，在不同的培养基上诱导不定芽，发现‘十月鲜’紫菜薹的子叶不定芽诱导频率最高。为确定‘十月鲜’紫菜薹子叶不定芽诱导最佳培养基，采用二次正交旋转组合设计研究了6-BA、NAA及AgNO3对‘十月鲜’子叶离体培养不定芽诱导频率的影响，发现3个因素对子叶不定芽诱导影响的主次关系为：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，最佳培养基是MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，不定芽诱导率达85.71%。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；子叶；离体培养；植株再生

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)是十字花科芸薹属作物，原产我国，是长江流域的特产蔬菜，在长江流域及以南各省普遍栽培。紫菜薹的食用部分为嫩花茎，花茎肥嫩，色泽鲜艳，脆嫩清甜，风味独特，含有丰富的维生素A、C，营养价值极高[1]。紫菜薹早熟品种和中晚熟品种分别于国庆、元旦、春节前后大量上市，深受大众的喜爱。作为优质高档蔬菜紫菜薹也被逐渐引种到全国各地栽培[2]。随着生活水平的不断提高，人们对紫菜薹生产和消费的要求也日益提高，因此需要选育更多的优良品种。采用基因工程技术导入目的基因改良遗传特性，无疑是紫菜薹育种的一个新途径。通过根癌农杆菌介导的转基因技术导入外源目的基因是植物遗传改良的一种有效手段，而应用这种技术的基础是建立高效的离体再生体系。尽管紫菜薹的组织培养早有成功的报道[3]，但是由于基因型不同，实际应用中仍存在许多问题。本研究旨在探讨激素配比和基因型对紫菜薹子叶离体培养不定芽诱导频率的影响，以期为紫菜薹的遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘十月鲜’、‘新选十月鲜’、‘原种九月鲜’、‘改良九月鲜’、‘早丰’和‘新世纪中杂’等6个紫菜薹品种的种子均为市售。

1.2 紫菜薹品种间子叶不定芽诱导的比较

(1)无菌苗的获得 以‘十月鲜’、‘新选十月鲜’、‘原种九月鲜’、‘改良九月鲜’、‘早丰’、‘新世纪中杂’等6个紫菜薹品种的种子为材料，挑选饱满的种子，70%乙醇消毒1 min后用无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl2浸泡10 min后用无菌水冲洗3次，然后接种于MS培养基中。每个三角瓶接种30粒种子，置于(26±1)℃、16 h光照及光照强度1 600 lx下培养。

(2)不定芽的诱导 根据前人报道[3]和预备实验的结果，采用3种组合的培养基，即培养基1：MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+7.5 mg/L AgNO3；培养基2：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3；培养基3：MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，进行不定芽的诱导。取5～8 d苗龄无菌苗带子叶柄的子叶作为外植体，接种诱导不定芽，20～25片/皿。30 d后统计不定芽诱导情况。

不定芽诱导率(%) =(产生不定芽的外植体数/接种的外植体总数)× 100

1.3 6-BA、NAA和AgNO3二次正交旋转组合设计诱导紫菜薹子叶不定芽

(1)无菌苗的获得 以‘十月鲜’紫菜薹为材料，操作步骤同1.2。

表1 因素水平及编码Table 1 Factor levels and coding

(2)不定芽的诱导 不定芽诱导培养基以6-BA、NAA和AgNO3的不同浓度组成3因素实验，采用二次正交旋转组合设计[4]，实施情况为全面实施，零水平试验重复9次，其变化范围及其编码如表1。不定芽诱导的具体操作同1.2。

(3)不定芽的生根诱导及植株移栽 将继代生长至长度1～1.5 cm的不定芽切下，转移至生根培养基(1/2MS+2 g/100 g蔗糖+0.8 g/100 g琼脂+5.0 mg/L AgNO3)上诱导生根。选长势良好的植株开瓶炼苗，洗去根部的培养基，移至装有培养土的营养钵中，塑料薄膜覆盖保湿2～3 d后按实生苗植株正常管理。

2 结果与分析

2.1 紫菜薹品种间子叶不定芽诱导率的比较

接种培养2～3 d后，紫菜薹子叶柄切口处开始膨大，3～4 d后部分切口形成愈伤组织；8～14 d后，子叶柄切口处以及愈伤组织表面产生紫色芽点，芽点逐渐增大，再生长2周左右，形成明显的紫色芽丛。6个紫菜薹品种在3种培养基上的子叶不定芽的诱导结果如表2。

方差分析结果表明，培养基间差异不显著，但品种间差异达到极显著(表3)。进一步分析表明，‘十月鲜’的子叶不定芽诱导率显著或极显著高于其他5个品种，‘早丰’的子叶不定芽诱导率显著或极显著低于其他5个品种。这表明，对这3种培养基而言，6个品种中‘十月鲜’紫菜薹的子叶不定芽诱导率最高，‘早丰’紫菜薹子叶不定芽诱导率最低。

表3 6个品种方差分析差异显著性Table 3 The significant difference of variance analysis between 6 cultivars

表2 不同品种不同培养基子叶不定芽诱导的结果Table 2 The induction result of cotyledon adventitious buds by different cultivars and different media %

2.2 6-BA、NAA和AgNO3对‘十月鲜’紫菜薹子叶不定芽诱导的影响

运用二次正交旋转组合设计的方法组成6-BA、NAA和AgNO33因素试验，子叶不定芽诱导结果如表4。

从表4可以看出，子叶不定芽诱导率最高达85.71%，最低为39.39%。方差分析结果(表5)表明，在本研究中，AgNO3浓度以5.0 mg/L左右为宜，过高或过低都不利于子叶不定芽的诱导；6-BA浓度以1.0 mg/L为宜，过高反而抑制不定芽的诱导；NAA各浓度之间的不定芽诱导率无显著差异。由表5的均值可选取‘十月鲜’紫菜薹子叶不定芽诱导的最佳培养基组合，即MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3。

表4 二次正交旋转试验设计及结果Table 4 Design and results of quadratic orthogonal rotary experiment

方差分析和极差的直观分析结果(表5)均表明，在因素水平范围内，6-BA、NAA和AgNO3对子叶不定芽诱导率影响的主次关系为：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，其中，AgNO3的极差最大，对子叶不定芽的诱导影响最大，是主要因素。

表5 子叶不定芽诱导结果的直观分析Table 5 Direct perceiving analysis of induction result of cotyledon adventitious buds

3 讨论

在芸薹属植物组织培养中，不同激素的浓度及其配比，在不同的报道中并不完全一致。目前报道最多的组合是BA+NAA，但适宜浓度因基因型而异。本研究中‘十月鲜’子叶芽诱导最佳激素配比为3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，这与前人在甘蓝型油菜[5]、大白菜[6]等芸薹属植物中的结果基本一致；与李汉霞等[3]在紫菜薹中的研究结果也接近，但本研究培养基中的6-BA、NAA水平略高，这可能是基因型和生理状态不同的缘故。许多研究也表明，不同基因型的芸薹属植物再生频率有显著的差异[7，8]。本研究比较了6个品种子叶不定芽的诱导频率，发现‘十月鲜’紫菜薹不定芽诱导率较高；进一步的二次正交旋转组合设计实验中，‘十月鲜’子叶不定芽诱导率达到了85%以上，可以进行遗传转化。

自Chi等[9，10]首先发现培养基中添加AgNO3能显著促进大白菜、白菜和菜心的子叶再生成芽以来，一般认为Ag+是较好的乙烯活性抑制剂，能竞争性地作用于乙烯作用部位，防止外植体产生过多的乙烯对植株再生的抑制作用[11]。通常认为AgNO3对芸薹属植物的再生分化有较大的影响，而且多认为适当浓度的AgNO3能显著地提高不定芽的分化频率[12～20]。本研究结果与此一致。而且本研究的二次正交旋转组合设计分析结果认为，AgNO3是影响紫菜薹子叶不定芽诱导的主要因素，在其他芸薹属植物中是否如此有待证实。此外，本研究中发现高浓度的AgNO3容易引起黄化现象，这与屈会玲等[21]在彩色大白菜中的研究结果一致。本研究发现紫菜薹不定芽生根较为困难，但生根后移栽较易成活，生根较为困难的原因仍需进一步研究。

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2009-12-08

湖北省教育厅重点项目(2007ABA386)

林小芳(1985-)，女，福建福州人，硕士研究生，主要从事园艺植物生物技术研究.

刘乐承，E-mail: lchliu18@yangtzeu.edu.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.015

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S060-03