响应面法优化沙棘中熊果酸提取工艺

鲁长征,山永凯,李树志,任蓓蕾

(青海清华博众生物技术有限公司,青海西宁 810016)

沙棘属于胡颓子科沙棘属植物,又名酸刺、醋柳。遍布欧亚大陆的温带地区,我国是沙棘资源最丰富的国家,主产于西南、西北等地[1]。研究表明,沙棘的根、茎、叶、花、果中含有糖类、V C、VE、多种氨基酸、亚油酸、黄酮类化合物、磷脂类化合物以及甾醇类化合物等200多种营养物质,其中具有抗炎抗菌、抗肝炎、抗氧化、降血糖等多种药理活性的物质——熊果酸,由于其独特的生物活性和对癌症的功能作用[2,3],近年来成为沙棘研究的热点,从沙棘果实加工的残渣中提取高纯度的熊果酸在国内还未见报道。青海沙棘因其生长于高原地区,品质较内地更优。为充分利用当地丰富的沙棘资源,本次实验利用RSM分析法,以提取果汁和沙棘种籽后的沙棘果皮渣为原料,得出提取熊果酸的最佳工艺参数,以期望为熊果酸的工业化生产提供一定理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

沙棘果皮渣 (产于青海)于105℃烘箱中烘干,粉碎,过筛,备用。

1.2 试剂

95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蒸馏水、熊果酸标准品、甲醇、乙酸等,均为分析纯。

1.3 仪器

FW-400A倾斜式高速万能粉碎机、BS323S型分析天平、HS.2型电热恒温水浴锅、PB-10酸度计、RE-52A旋转蒸发仪、SHB-3循环水多用真空泵、DG/20-002台式干燥箱等。

1.4 方法

1.4.1 提取路线

1.4.2 提取方法

准确称取原料5g,按1∶40加氯仿回流3h脱脂,回收溶剂,残渣挥发干溶剂,按料液比1∶20加入夹带剂,按照一定萃取压力、萃取温度、CO2流量、原料粒度进行超临界CO2萃取,最后离心得提取液,即为熊果酸粗提液。

1.4.3 熊果酸的测定

1.4.3.1 色谱条件

色谱柱:Luna 5u C18(2),250mm ×4.6mm;Shimpack VP-ODS,150mm×4.6mm,5μm;检测波长为215nm;流动相为0.1mol/L,甲醇∶冰醋酸 (体积比为85∶15);流动相流速为0.8ml/min,柱温为25℃;进样量:20μl;数据处理为外标法峰面积定量。

1.4.3.2 标准对照溶液配制

称取熊果酸标准样品 24.0mg,置于 10ml容量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,得含熊果酸2.40mg/ml的标准溶液。分别精密吸取标准溶液 0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml,置于5ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,进样20μl,测定峰面积。以峰面积平均值为纵坐标,其对应进样质量浓度为横坐标,进行回归计算,得线性方程为:

熊果酸浓度在 35～1120μg/ml,线性关系良好。

1.4.3.3 样品溶液的制备

移取 1ml熊果酸提取液,用甲醇定容至25ml,用微孔滤膜 (0.45μm)滤过,精密吸取10μl,按上述色谱条件进行测定。重复进样3次,取均值,根据回归方程计算熊果酸的量。

1.5 试验方案

1.5.1 单因素试验

主要分析夹带剂、萃取压力、萃取温度、CO2流量、原料粒度5个单因素对熊果酸浸出率的影响。单因素实验水平见表1。

表1 单因素实验水平

1.5.2 响应面分析试验

根据Box-Benhnken中心组和试验设计原理[4,5],采用三因素三水平的响应面分析方法,根据单因素试验结果选取因素水平。试验因素水平设计见表2。

2 结果与分析

表2 试验因素水平

2.1 单因素试验结果

2.1.1 夹带剂对熊果酸浸出率的影响

在进行预实验时,不加夹带剂时,熊果酸的提取效果很差,通过检测,没有或者只有少量熊果酸浸出,因此,必须加入夹带剂。但夹带剂的加入量要适当,如果量太少,起不到作用,但量过多会改变萃取性质,使萃取主要在非临界的液态下进行,这样往往达不到理想的萃取效果。由图1可见,95%乙醇的熊果酸浸出率比其他溶剂高,而且95%乙醇价格低廉、原料丰富、安全可靠,适合工业化生产,故选择95%乙醇作夹带剂,加入量为物料干质量的30%。

2.1.2 萃取压力对熊果酸浸出率的影响

由图2可以看出,在其它参数固定的条件下,萃取率随萃取压力的升高而增大,在5～20 MPa之间这种增加较为明显,超过20MPa时,萃取率增大不明显。考虑到过高的压力不仅对设备和操作提出更高的要求,生产成本也会相应增加,因此综合考虑萃取压力选择20MPa。

2.1.3 萃取温度对熊果酸浸出率的影响

由图3可以看出,萃取温度在25～40℃之间,随温度升高熊果酸浸出率增大,但在45℃时,熊果酸浸出率反而下降。这可能是因为继续升温时,CO2密度降低,其溶解能力也相应降低,使浸出率下降;再者因为温度过高会对熊果酸有一定程度的破坏。故最佳萃取温度选择40℃。

2.1.4 CO2流量对熊果酸浸出率的影响

CO2流量是影响浸出率的一个重要因素。一方面CO2流量增加,超临界CO2在萃取器中的停留时间减少,使流体与有效成分接触时间减小,萃取平衡受到影响;另一方面,流体流量增加,增加了流体的扰动,使传质速度加快,有利于萃取速率及萃取率的提高。随着CO2流量的增大,萃取率也增大。但流量若过大,与物料接触不够充分,萃取率会逐渐趋于缓和,且流量的增大会增加操作费用。综合考虑,流量选择20L·h-1为宜。

2.1.5 原料粒度对熊果酸浸出率的影响

由于粒度直接影响到熊果酸提取的操作周期和浸出率。粒度大小直接与总表面积和固相传质系数有关。粒度越小,总表面积越大,传质越快,与流体接触面积越多,浸出率越高。从图5可知,随物料粒度变小,浸出率不断提高,但从20～100目萃取率提高幅度不大,考虑到工业上粉碎的难度和能耗,综合分析,选择最佳粒度为80目。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 试验结果

选取萃取压力、萃取温度、CO2流量作为自变量,以熊果酸浸出率为响应值Y,试验设计与结果见表3。其中1～12是析因试验,13～15是中心试验,用来估计实验误差[6]。

表3 试验设计与结果

2.2.2 回归方程及方差分析

熊果酸浸出率 (Y)与萃取压力 (X1)、萃取温度 (X2)、CO2流量 (X3)三因素之间的反应曲面拟合方程为:

用F值检验来判定,概率P值越小,其相应变量的显著性越高。从表4中可以看出,方程一次项、二次项的影响都是显著的,交互项影响不显著,故交互项可以省略。因此,各具体试验因子对响应值的影响并不是简单的线性关系。方程复相关系数的平方R2=90.89%,说明响应值的变化有90.89%来源于所选变量,可以用此模型对熊果酸浸出率进行分析。在所选的各因素水平范围内,按照对结果的影响排序:X3＞X1＞X2,即:CO2流量＞萃取压力＞萃取温度。

表4 回归方程的方差分析

2.2.3 等高线图与响应面图分析

比较3组图可知:CO2流量对熊果酸浸出率的影响最为显著,其次是萃取压力,表现为它们的曲线都较陡,而萃取温度的改变对熊果酸浸出率的影响相对较小,曲线变化较为平滑。

2.2.4 基于实验编码值的响应值的典型分析结果

?

稳定点的估计值为：378.9941。

?

从典型分析表6中可以看出，特征值均为负值,稳定点位最大值,即在点 (0.50709,0.08177,0.66305)处响应值对应最大值。所以利用超临界CO2提取熊果酸的最佳提取条件为:萃取压力为 22.5MPa,萃取温度为 40.4℃、CO2流量为23.3L·h-1。在此条件下熊果酸浸出率为:374mg/100g,与实验预测值378.9941非常接近。

3 小结

实验证明运用RSM方法对沙棘中熊果酸的提取工艺进行优化是非常有效的。通过响应面分析法建立各因素与响应值之间的数学模型,可以直观地看出各因素及各因素之间的作用,进而对最佳制备工艺参数有很大帮助,提高了工作效率。

熊果酸的提取工艺最佳参数为:萃取压力为22.5MPa,萃取温度为 40.4℃、CO2流量为23.3L·h-1。在此条件下熊果酸浸出率为:374mg/100g,与实验预测值378.9941非常接近。

[1]顾晶晶,王爱芹,康健.响应面方法研究新疆大果沙棘的果酒酿造工艺[J].食品工业科技,2008,8:224-226.

[2]郑艳,苏丹.女贞子中熊果酸的提取工艺研究[J].陕西科技大学学报,2008,8,(4):85-88.

[3]李钐,王亚楠,万梓龙,等.山楂中熊果酸与齐墩果酸提取和纯化工艺的研究 [J].食品科学,2007,7(28):141-144.

[4]张鸣镝,王章存.响应面分析法优化玉米胚芽蛋白的提取工艺研究 [J].农产品加工,2008,7(142):174-178.

[5]杨芙莲,任蓓蕾,夏银.陕北荞麦壳中生理活性成分的研究 [J].食品科学,2007,12(28):156-161.

[6]姚凌云,宋玉乔,李教社,等.中国沙棘叶化学成分的研究 (Ⅱ)[J].沙棘,2002,2(16):33-34.