电场强度对线性丙烯酰胺毛细管电泳特性的影响

汪 洁， 王立强， 石 岩， 郑 华， 陆祖康

(1.广东技术师范学院电子与信息学院， 广东广州 510665; 2.浙江大学现代光学仪器国家重点实验室，国家光学仪器工程研究中心， 浙江杭州 310027; 3.福建师范大学物理与光电技术学院，福建福州 350007)

电场强度对线性丙烯酰胺毛细管电泳特性的影响

汪 洁1， 王立强2， 石 岩2， 郑 华3， 陆祖康2

(1.广东技术师范学院电子与信息学院， 广东广州 510665; 2.浙江大学现代光学仪器国家重点实验室，国家光学仪器工程研究中心， 浙江杭州 310027; 3.福建师范大学物理与光电技术学院，福建福州 350007)

使用2种不同质量分数(4%和6%)的线性聚丙烯酰胺(Linear Polyacrylamide，LPA)作为筛分介质，对片段长度为80～584 bp 的标准DNA样品进行毛细管电泳. 利用激光诱导荧光方法检测信号，荧光染料为溴化乙啶. 改变电场强度从100～375 V/cm，得到电泳电流、迁移率、信号强度、半峰宽以及分辨率的变化曲线. 实验测得电场强度与电流有很好的线性关系，非线性度参数γ分别为0.999 44和0.998 76. 迁移率曲线与电场强度、DNA片段长度成复杂的函数关系，DNA的迁移率依赖于电场强度、筛分介质质量分数和片段长度；电场强度对信号强度的影响较小，筛分介质的质量分数对区带展宽有影响，因此也影响了信号强度，使用4% LPA比6% LPA区带展宽小，信号强度高，更适合分离片段长度≤600 bp的DNA样品. 电场强度对分辨率的影响十分复杂，增大电场强度并不能提高分辨率，为了提高分辨率，优化分离电场强度为125 V/cm，理论分析对实验起到了很好的指导作用.

毛细管电泳； 电场强度； 迁移率； 分辨率

近年来，在DNA序列测定中，对凝胶电泳发展的一个热点就是提高DNA的分离速度，从而相应减少电泳时间以提高效率.最简单的一种减少电泳时间的方法就是提高分离驱动电场强度，但同时也增加了迁移过程中的热传递效应.

在电泳中常用迁移率(μ，也称为淌度Mobility)，而不用速度来描述荷电粒子的电泳行为与特性，电泳迁移率定义为单位场强下离子的平均电泳速度：

μ=v/E=q/6πηr.

(1)

从式(1)来看，迁移率与电场强度无关，但在实际溶液中，离子不可能只有1个，电泳的有效淌度还和离子半径、溶剂化作用、介电常数、溶剂粘度、离子形状、电荷、pH值、离解度等因素有关.在实验中，电场强度很大程度上影响着电泳迁移率.

对于毛细管中的热效应，可以通过测量毛细管两端电流来考察.电场强度的变化对电流、相邻条带淌度或电迁移率μ、凝胶电泳中的区带展宽以及分辨率起着重要作用，因此在实验数据基础上建立半实验的理论模型研究对毛细管电泳条件优化特别重要.SLATER[1-2]等研究了电场强度对不同浓度的琼脂糖凝胶为筛分介质的DNA电泳特性(2 000～4 850 bp)，模拟讨论了迁移率和DNA分子大小，迁移率与胶浓度的关系，提供了一个广泛应用的相关图形.LUCKEY等[3]分析了以交联聚丙烯酰胺为筛分介质的凝胶毛细管电泳，发现提高电场强度能减小带宽却伴随分辨率降低，选择最佳的实验电场强度要综合考虑电泳速度与分辨率的影响.高场强下DNA片段的带宽减小是因为减少了扩散加宽，然而由于热效应又会使区带展宽，他们还讨论了扩散和热梯度效应对常场强下毛细管凝胶电泳性能的影响，确定获得最佳分辨率的优化电场强度.不过，对于可替换的线性聚丙烯酰胺(Linear Polyacrylamide, LPA)凝胶为筛分介质，电场强度对其毛细管电泳特性在信号强度、加宽、分辨率等方面的影响未见文献报导.

在最近的工作中，我们利用质量分数为4%LPA和6%LPA(下同)进行毛细管电泳，针对所使用的DNA样品，高于或低于这个质量分数，效果都不好，质量分数低于4%，筛分性能下降，不能良好地分离；质量分数高于6%，灌胶与清洗难度大.电场强度变化范围从100～375 V/cm，在同一检测系统下保持样品、进样时间、进样电压、采样频率、毛细管涂层与长度等实验条件不变，进行毛细管电泳分离实验.实验考察了电场强度对电泳电流、迁移率、信号强度、半峰宽及分辨率的影响，进一步优化了电泳参数.

1 实验部分

1.1实验仪器

凝胶毛细管电泳信号由自行设计的激光诱导荧光系统[4-5]检测，不同的电场强度下，光电倍增管数据采集频率为50 Hz，采用电动进样，由计算机程序精确控制进样时间和进样电压，从而消除进样量的偏差(300 V/cm，进样5 s)，毛细管温度由TEC装置进行温控，从进样端直至检测端，在毛细管电泳检测实验中，温度保持在40 ℃.

1.2凝胶制备

所用毛细管采用文献[6]的方法完成内部线性聚丙烯酰胺涂层，能良好地控制电渗流并抑制吸附.实验中所用凝胶的质量分数分别为4%和6%线性聚丙烯酰胺，采用高压灌入，毛细管的尺寸为外径375 μm，内径50 μm，长度18 cm，有效长度为12 cm.凝胶聚合好后，可以重复灌胶，每次灌胶后，毛细管两端插入1×TBE(89 mmol·L-1Tris /89 mmol·L-1H3BO3(硼酸)/2 mmol·L-1EDTA, pH 8.3)缓冲液中，100 V/cm电场强度下进行预电泳15 min.这种采用缓冲液平衡凝胶的过程能够使胶均匀，在以后电泳中不会产生传导率变化.

1.3样品准备

实验中用到的荧光染料为溴化乙啶(Ethidium Bromide, EB，Aldrich 产品, 国内分装)，样品为pGEM-3Zf(+)/Hae III Markers(华美生物工程有限公司)，所用水为去离子水(电阻率为18.23 MΩ·cm，优普超纯水机，成都超纯科技有限公司).将0.5 μg/μL pGEM-3Zf(+)/Hae III Markers用去离子水稀释100倍，最后体积为100 μL，足够40次进样.EB结合(嵌入)双链DNA后荧光增强20～30倍[7-8]，其吸收峰位于紫外波段，在532 nm处有1个次吸收峰，发射峰在603 nm，量子产率为0.15.

2 结果与讨论

2.1电泳电流与电场强度的关系

电场强度E是进样和电泳分离时的动力[9]，它的值为加在微通道毛细管两端的电压值除以毛细管的长度，实验中毛细管长度保持不变，因此一定的电压值就对应一定的电场强度.高稳定度的电压是获得迁移时间重现性的必要条件，分离体系的最佳外加电压值，与缓冲液浓度(离子强度)及毛细管内径和长度有关.根据欧姆定律，电流和电压具有线性关系，如果CE系统不能及时有效地散发产生的焦耳热时，缓冲溶液电阻降低，负载变小，电流的增加偏离线性.本DNA分析系统采用瞬间升压的恒压操作模式，由于使用线性聚丙烯酰胺作为筛分介质，电场强度控制在150～400 V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏.图1是使用同一根涂层毛细管，先后灌入4%和6%LPA两种不同筛分介质进行DNA分离实验，得到电场强度与电流关系曲线，所用缓冲溶液都是1×TBE.

图1 4%LPA与6%LPA凝胶管电泳电压与电泳电流的关系图

Fig.1 The relationship between voltage and current of electrophoresis with 4%LPA and 6%LPA gel

从上图中看出2种不同质量分数(4%LPA和6% LPA)线性聚丙烯酰胺凝胶管在电场强度为150～375 V/cm时，实验测得场强与电流曲线有较好的线性关系，两者的非线性度参数γ分别为0.999 44和0.998 76.γ总是在0和1之间，越接近于1，数据的线形越好.对于本实验测得的数据，γ已经很接近于1，这表明各数据点较好地分布在一条直线上.可见在这个范围内，毛细管能够较好地散热，可以忽略凝胶内部由于场强增加而引起的整体温升.同时研究也发现，4%线性聚丙烯酰胺凝胶管在同样电场强度下，电泳电流较6%LPA大，表现出电阻低.使用相同浓度的缓冲溶液，因为中性筛分介质量的增加，6%LPA较4%LPA的离子浓度略微下降，且溶液粘度发生变化，表现出电阻高，因而获得如上图的电场强度与电流不同的对应关系.

2.2迁移率与电场强度的关系

图2是选用4%和6%LPA作为筛分介质，在100、200、250 V/cm电场条件下的片段长度与迁移率对数的关系图.

图2 4%LPA和6%LPA凝胶介质中迁移率与片段长度的关系图

Fig.2 Mobility versus DNA fragment length with 4%LPA and 6%LPA

迁移率与电场强度[10-11]、筛分介质质量分数和片段长度3个因素有关[3, 12]，成复杂函数关系[13].图2可以看到，同一场强下，迁移率随着DNA片段长度的增加而下降，这符合电泳分离的原理；对DNA样品中同一片段长度，随着电场强度的增加，迁移率上升，并不象式 (1) 描述的迁移率与场强无关，电场强度对迁移率的作用明显；筛分介质质量分数由4%提高到6%，迁移率随场强变化而变化的趋势和4%LPA一致，但在数值上会整体下降，这说明6%LPA的筛分孔径比4%LPA更小、更密集，DNA大分子要找到一个可利用的筛孔更困难，因此迁移率整体下降.

2.3电场强度对荧光信号强度的影响

不同的电场强度下电泳，对不同长度的DNA片段，理论上说，片段长度越大，样品条带的浓度越高，信号强度越强.但由于加宽机制的影响，实际结果并不完全是这样.图3是标准样品pGEM-3Zf(+)/Hae III Markers在不同电场强度下检测到的荧光信号强度与不同长度的DNA片段的关系图，筛分介质为4%LPA.图中可以看出，电场强度从125～375 V/cm变化范围内，不同长度的DNA片段的信号强度的变化趋势基本一致，对于13条长度为11～587 bp的片段组成的DNA Markers，在102、323、458 bp分别有极大值.

Fig.3 The relative fluorescence signal intensity versus the fragment size with 4%LPA

筛分介质为6%LPA也有类似的荧光信号强度与片段长度的关系，如图4，只是整体信号强度有所下降，特别是在极大值458 bp处的信号强度比4%LPA条件下下降了1倍左右.

图4 6%LPA相对荧光信号强度与不同片段大小的关系图

Fig.4 The relative fluorescence signal intensity versus the fragment size with 6%LPA

取实验标准样品pGEM-3Zf(+)/Hae III Markers中荧光信号较大的2个信号峰片段458 bp和323 bp为研究对象,比较电场强度对荧光信号强度的影响如图5所示.图中表明电场强度对信号强度的影响不是线性的增函数，有一定起伏，在一定范围内波动.还明显看出使用4%LPA相同DNA片段的信号强度较6%LPA强.

图5 2片段458 bp和323 bp分别在4%和6%LPA中的电场强度与相对荧光信号强度对比图

Fig.5 Electric fields strength versus relative fluorescence signal intensity of 458bp and 323 bp with 4% and 6%LPA

2.4电场强度对最大半峰宽的影响

CE分离的基础是溶质电迁移速度的差异，电迁移过程中，各种组分区带不仅由于它们的迁移速度不同而被分离，而且亦由于一系列分散因素使区带增宽.图6是4%LPA和6%LPA两种不同筛分介质条件下的半峰宽与片段长度关系图，分别在100、200、250 V/cm电场条件下，对于2种筛分介质，不同长度DNA片段的半峰宽变化趋势相一致，都在323、458 bp处有半峰宽极小值.对于筛分介质为6%LPA，虽然它的质量分数高，筛分孔径小，但是最大半峰宽都比4%LPA要高.结合图3、图4荧光信号强度与片段长度关系图来看，基本上是在半峰宽最小的几个片段处，信号强度有极大值.因为使用6%LPA的峰加宽相对4%LPA大一些，所以对应片段的信号强度要低于4%LPA.要提高荧光信号强度和信噪比，就应尽可能地减少区带展宽.因此，从减小峰加宽的角度来说，4%LPA更适合分离片段长度≤600 bp的DNA样品.

图6 4%LPA 与6%LPA凝胶管的最大半峰宽与片段长度的关系图

Fig.6 The relationship between width at half height and fragment size with 4%LPA and 6%LPA

图7为不同电场强度条件下，458 bp DNA片段在4%和6%LPA筛分介质中实验得到的半峰宽.

图7 片段458 bp在4%LPA 与6%LPA的半峰宽

Fig.7 The width at half height of 458 bp with 4%LPA and 6%LPA

图7可看出，电场强度对DNA片段半峰宽的影响也是振荡波动的，这是由于电场强度不同引起样品扩散加宽和热加宽各不相同的一个综合效应，因此用实验方法获得最佳电泳电压是十分重要的.对不同质量分数的LPA而言，两者半峰宽随场强变化的趋势基本一致，4%LPA的半峰宽比6%LPA小，由此推知在2种使用最普遍的质量分数4%和6%LPA下，增大筛分介质质量分数，减小筛分孔径，使DNA片段分离速度变小，迁移率降低，但由于增加了峰加宽，信号荧光强度下降.

2.5分辨率与电场强度的关系

图8是取实验测量的标准DNA样品中相差最小的2个片段314 bp和323 bp的迁移时间计算ΔtR，通过ΔtR、半峰宽HW1和HW2的值来计算分辨率.电场强度(100～375 V/cm)对分辨率的影响十分复杂，在这一范围内近似周期性振荡，增大电场强度并不能增加分辨率.在125 V/cm的电场强度下，4%LPA和6%LPA的分辨率都较高.因此，要提高分辨率，实验优化电泳分离电场强度为125 V/cm.

图8 电场强度与分辨率的关系图

Fig.8 The relationship between resolution and electric field strength

3 结论

电场强度是电泳分离中一个重要的参数，它对迁移特性有不同程度的影响.利用自行设计的激光诱导荧光检测系统，对标准DNA样品进行线性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过实验研究揭示了电场强度在一定范围内变化(100～375 V/cm)对电泳迁移特性的影响.实验测量得到2种不同质量分数4%LPA和6%LPA凝胶毛细管电泳电流的变化，电流与电场强度有良好的线性关系，两者的非线性度参数分别为0.999 44和0.998 76，表明毛细管能有效地散热，因此可以忽略凝胶内部由于场强增加而引起的整体温升；考查了DNA样品中不同长度的片段在2种不同质量分数筛分介质中迁移率的变化趋势，它与电场强度、片段长度以及筛分介质质量分数成复杂的函数关系；从所得数据曲线中看出，电场强度对信号强度及区带展宽有不规则的影响，这是因为提高电场强度可以减小扩散展宽但同时又增加了热加宽，而区带展宽对信号强度有影响，区带展宽小信号强度才会提高.筛分介质的质量分数对区带展宽影响较大，4%LPA的区带展宽小，信号强度也相对较6%LPA高；因此，从减小区带展宽和提高信噪比的角度来说，4%LPA更适合分离片段长度≤600 bp的DNA样品.

考察了不同电场强度下，分析样品中最接近的2个片段314 bp和323 bp的分辨率，通过实验测得的迁移时间和半峰宽的值，由公式计算得到分离分辨率，电场强度对分辨率的影响十分复杂，为提高分辨率，优化电场强度为125 V/cm，所得的数据与理论分析对实践起到了很好的指导作用.

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Keywords： capillary electrophoresis; electric field strength; mobility; resolution

【责任编辑 成 文】

ELECTRICFIELDSTRENGTHEFFECTONTHECAPILLARYELECTROPHORESISCHARACTERISTICSINLINEARPOLYACRYLAMIDE

WANG Jie1, WANG Liqiang2, SHI Yan2, ZHENG Hua3, LU Zukang2

(1. School of Electronics and Information, Guangdong Polytechnic Normal University, Guangzhou 510665, China; 2. State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, Zhejiang University, Hangzhou, 310027, China; 3. School of Physics and Opto-Electronics Technology, Fujian Normal University, Fuzhou, 350007, China)

Capillary electrophoresis of DNA fragments (from 80 bp to 584 bp) in replaceable linear polyacrylamide (LPA) solution was investigated using laser induced fluorescence detection. The fluorescence dye was Ethidium Bromide (EB). When the electric field strength was changed from 100 V/cm to 375 V/cm, the variation curves about current, mobility, signal intensity, width at half-height and the resolution were obtained. The nonlinearity parameter of experimental current and electric field strength are 0.999 44 and 0.998 76 with 4%LPA and 6%LPA respectively, which shows good linear relationships. The mobility is varied as a complex function of fragment size and electric field; the electrophoresis mobility depends on the applied electric field strength, the concentration of gel matrix and the size of the fragment. The electric field strength has effect on the signal intensity little, but the gel matrix concentration affects the peak width so it affects the signal intensity. The broadening is less and signal intensity is higher with 4% LPA than that with 6% LPA. It shows 4% LPA is more suitable for separating DNA samples which the fragment size ≤600 bp. The electric field strength affects resolution complicatedly; the resolution cannot be increased if only increasing the electric field strength. In order to increase the resolution, the optimum electric field strengths are 125 V/cm. The analysis above is very useful for experiment.

2009-02-28

国家自然科学基金资助项目(60378042)

汪洁(1973—),女,湖北武汉人,博士, 广东技术师范学院讲师, 主要研究方向：生物荧光光学仪器，Email:janew03@gmail.com.

1000-5463(2010)01-0052-06

O657.8

A