酱油曲霉发酵芝麻饼粕发酵基质的优化

邵元龙,董 英

江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013

酱油曲霉发酵芝麻饼粕发酵基质的优化

邵元龙,董 英＊

江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013

采用响应面法对酱油曲霉发酵芝麻饼粕提高抗氧化能力的发酵基质组成进行了优化。通过 Plackett-Burman设计法,评价了麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦麸、玉米浆、酵母膏和硫酸铵等 8个因素对 DPPH自由基清除能力的影响。筛选出麦麸、葡萄糖和硫酸铵为影响芝麻饼粕发酵提取物抗氧化活性的 3个显著因素,然后用Box-Behnken试验设计和响应面分析法,对 3个关键因素进行了探讨与优化。优化的发酵条件为:葡萄糖、硫酸铵和麦麸添加量分别为:1.87%、1.54%和 2.55%。在该试验条件下,DPPH自由基清除率为 80.26%,比未发酵的芝麻饼粕高37%。

芝麻饼粕;发酵;优化;抗氧化活性;酱油曲霉

国内外对芝麻饼粕中抗氧化物质的研究日趋深入,如对芝麻素的提取工艺、检测方法[3-7]的研究。2003年,日本的Ohtsuki[8]等,用环状芽孢杆菌 YUS-2液体发酵芝麻饼粕,发现两种新的具有更强抗氧化能力的物质。2005年,日本的 Yoshiaki[9]等采用Aspergillus分别发酵芝麻素 (Sesamin)和三糖基芝麻素酚 (Sesaminol Triglucoside),转化生成了具有儿茶酚结构的新物质,并显示更强的抗氧化活性。2007年,董英[10]用酱油曲霉发酵芝麻饼粕,发现可以提高其抗氧化活性,但并未对发酵条件进行优化。因此,本文仍选用该菌株对芝麻饼粕进行发酵,以抗氧化活性为指标,对发酵培养基组分进行优化,为对发酵芝麻饼粕中抗氧化物质的提取,分析和转化机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

菌株:酱油曲霉 (Aspergillus sojae),CICC2128:购自中国工业微生物菌种保藏中心;芝麻饼粕:江苏镇江京友调味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH):美国 Sigma公司。

JJ-1型电动搅拌器:江苏金坛医疗仪器厂;LD5-10离心机:北京医用离心机厂;WFJ-72000可见分光光度计:尤尼柯 (上海)仪器有限公司;Y M50A电热蒸汽压力灭菌器:上海三申医疗器械有限公司; PSX智能型恒温恒湿培养箱:宁波来福科技有限公司。

1.2 发酵方法

1.2.1 Plackett-Burman试验设计

酱油曲霉接种于土豆汁 (PDA)斜面培养基上, 28℃培养 72 h后,加入 10 mL无菌生理盐水,用接种针刮下,调节菌液浓度为 0.86×108cfu/mL。将粉碎的芝麻饼粕在烘箱中烘干,按料液比为 1∶3的比例加入正己烷,45℃水浴搅拌 3 h,4000 r/min离心 10 min,得脱脂芝麻饼粕。取 10 g烘干的脱脂芝麻饼粕加入9 mL溶解有不同成分的溶液,于 121℃灭菌 20 min,冷却后,接种 1 mL制备好的种子悬液,摇匀,于 28℃条件下发酵 144 h。

根据 Aspergillus生长所需营养要素的基本原则和发酵影响因素的一般规律,结合相关的文献报道和前期的实验,选用试验次数 N=12的试验设计,对麦芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖 (D)、果糖 (E)、麦麸(G)、玉米浆(H)、酵母膏 (K)和硫酸铵 (L)8个因素进行考察,分别对应于表中的 8列,每个因素取两个水平,响应值为提取液对DPPH自由基清除率(RSA%)。另设 3个虚拟列,以考察实验误差。对实验结果进行分析,得出各因素的 F值和可信度水平。一般选择可信度大于 90%以上的因素作为重要因素。实验因素水平设计见表 1。

1.提高认识，统一思想，构建企业大党建工作格局。非公企业党组织是党在企业中的战斗堡垒，在企业职工群众中发挥政治核心作用，在企业发展中发挥政治引领作用。明确“两个作用”，引导社会各界认同和重视非公企业党建工作，探索建立在党委和组织部门领导下的各部门分工协作工作机制，构建企业大党建工作格局。

表 1 Plackett-Burman试验设计的因素水平Table 1 Levels of independent variable in Plackett-Burman design

1.2.2 Box-Behnken试验设计

Plackett-Burman试验方差分析表明,酱油曲霉固体发酵芝麻饼粕提取物的 RSA影响显著的外界因子为葡萄糖 (P<0.05)、硫酸铵 (P<0.01)和麦麸(P<0.05)。试验中响应值为DPPH自由基清除率(RSA%),试验因素随机编码为:葡萄糖 (X1)、硫酸铵(X2)和麦麸(X3),试验因素及水平设计如表2所示,发酵条件与 Plackett-Burman试验一致。

表 2 Box-Behnken试验因素及水平Table 2 Levels of independent variable in Box-Behnken design

1.3 提取方法

发酵结束后,每瓶加入 80%乙醇 75 mL,50℃水浴搅拌提取 2 h,转速 150 r/min。上清液于 5000 r/min离心 10 min。沉淀按同样条件重复提取一次,合并上清液,定容至 150 mL。

1.4 DPPH自由基清除率测定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取发酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀释 10倍,作为样品液。DPPH溶液浓度为 7.5×10-6mol/mL,波长 517 nm,50%乙醇为对照。每个样品重复测定两次,求平均值。

计算公式为:

式中:A0—5 mL DPPH与 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai—5 mL DPPH与1 mL样品反应后的吸光度;Aj—5 mL乙醇与 1 mL样品混合液的吸光度[11]。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman设计及结果分析

Plackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法,它基于非完全平衡块原理,可以用最少试验次数估计出因素的主效应,适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素,供进一步研究用。对实验结果进行分析,得出各因素的F值和可信度水平。一般选择可信度大于 90%以上的因素作为重要因素[12]。Plackett-Bur man试验 设计的实验结果见表 3。

表 3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design matrix and exper imental results of Plackett-Burman

由表 4各因素效应分析结果可知,经过菌株Aspergillus发酵后,葡萄糖、麦麸和硫酸铵三个因素对提取液清除 DPPH自由基影响显著,可信度在90%以上,对此三因素进一步做响应面实验。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小,正效应的因素均取较高值,负效应的因素均取较低值。

表 4 Plackett-Burman试验设计结果相关系数和方差分析结果Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the Plackett-Burman design result

2.2 Box-Behnken试验设计及结果分析

Box-Behnken优化试验设计和结果见表 5,利用Desig-Expert 7.0软件,对表 5中数据回归拟合,获得Aspergillus发酵芝麻饼粕的提取物抗氧化能力对自变量葡萄糖、硫酸铵和麦麸的二次多项回归方程:

表 5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design matrix and experimental results ofBox-Behnken

-1 0 -1 7 0 . 2 6 6 1 0 -1 7 5 . 5 4 5 -1 0 1 7 2 . 4 6 8 1 0 1 7 9 . 6 4 7 -1 -1 6 9 . 8 5 1 0 0 1 -1 7 1 . 2 1 1 0 -1 1 7 5 . 1 4 1 2 0 1 1 7 7 . 7 5 1 3 0 0 0 7 8 . 7 9 1 4 0 0 0 7 8 . 2 6 1 5 0 0 0 7 7 . 8 8 9 0

模型方差分析见表 6,试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性 (P=0.0229),失拟项不显著 (P=0.0569),其校正系数 R2=0.926,表明有约92.6%的抗氧化能力能由此模型进行解释。所以自由基清除率与预测值之间具有较好的拟合优度,可用于 Aspergillus固体发酵提高抗氧化能力的分析和预测。表 6中,3个试验因素中 X1和 X3对发酵提取物清除DPPH自由基能力的影响极显著。硫酸铵和因素的交互作用影响皆不显著。

表 6 Box-Behnken试验结果方差分析Table 6 Analysis of variance for the Box-Behnken design result

2.3 模型验证

表7 模型验证Table 7 Model verification

?

为验证Aspergillus固体发酵提高抗氧化能力模型方程的合适性和有效性,在葡萄糖、硫酸铵和麦麸试验水平范围内,选择性地进行了 5组不同组合的实际验证试验 (表 7),同时设两组未添加任何营养物质的芝麻饼粕作为对照。利用 SPSS(version 14.0)软件对表 7中数据进行距离相关分析得知,自由基清除率实测值与预测值的相关系数 r为0.865,证明此模型是合适有效的,并具有一定的实践指导意义。选择 1号验证试验的因素组合作为优化的结果,即葡萄糖:X1=1.87%、硫酸铵:X2= 1.54%、麦麸:X3=2.55%,该条件下,芝麻饼粕发酵提取物清除 DPPH自由基活性为 80.26%,与未发酵的芝麻饼粕相比,活性提高 37%。

3 结论

3.1 用 Plackett-Burman试验设计,筛选出影响芝麻饼粕发酵提取物抗氧化活性的关键因素由强到弱的顺序为麦麸、葡萄糖和硫酸铵。在试验因素水平范围内,清除DPPH自由基能力随含量的提高而增大。3.2 用 Box-Behnken试验优化 Aspergillus固体发酵芝麻饼粕提高抗氧化能力的二次多项数学模型方程为:RSA%=78.31+2.22 X1+0.84 X2+2.27 X3-0.39 X1X2+0.48 X1X3+0.32 X2X3-1.77-2.76-2.06,且该方程的预测值与实际值相关系数 r为 0.865,符合程度高,具有一定的指导意义。根据方程优化的参数,获得较优的发酵条件为:葡萄糖、硫酸铵和麦麸添加量分别为:1.87%、1.54%和 2.55%,在该条件下发酵,DPPH自由基清除率为 80.26%,比未添加营养物的芝麻饼粕高37%。

通过该优化试验,为进一步对发酵饼粕中抗氧化物质提取工艺优化、组分分析,以及发酵机制的研究奠定了基础。

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Optim ization the Substrate of Sesame Cake Fermentation byAspergillus

SHAO Yuan-long,DONG Ying＊
School of Food and B iological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China

Response surface methodology was used to optimize the substrate composition of improving the antioxidant activity in solid-state fermentation sesame cake byAspergillus sojae.The effects of maltose,glucose,sucrose,fructose, wheat bran,corn steep,yeast extract,and ammonium sulfate onDPPH radical scavening activitywere evaluated by Plackett-Burman design.The results showed that wheat bran,glucose,and ammonium sulfate were the main affecting factors and had significante effects on antioxidant activities.Then,the central composite design and response surface analysis were used to deter mine the optimal levels of the main factors.The optimized fer mentation conditions were as follows:amount of glucose,ammonium sulfate and wheat bran were 1.87%,1.54%,and 2.55%,respectively.Under this condition,the DPPH radical scavening abilitywas 80.26%,which is higher 37%than that of control.

sesame cake;fermentation;optimization;antioxidant activity;Aspergillus sojae

1001-6880(2010)06-1088-05

2008-12-15 接受日期:2009-04-09基金项目:江苏省科技攻关项目(BE2005335)

＊通讯作者 E-mail:ydong@ujs.edu.cn

TS.201;Q939.97

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